番茄WD40家族SlWDR204调控植株形态建成的功能分析

作物的株高是非常重要的农艺性状,影响农作物的品质和产量.植物中WD40蛋白在细胞周期调控等方面具有重要作用.克隆了番茄SlWDR204基因,利用植物基因工程技术,构建植物过表达载体pBI121-35S::SlWDR204,通过农杆菌介导法获得过表达转基因植株.生物信息学分析表明该蛋白含有典型的WD40蛋白基序.定量RT-PCR分析发现在番茄各器官及果实发育不同时期该基因均有表达.观察发现SlWDR204过表达转基因植株相对于野生型植株,表现出较长的茎秆长度,表明该基因是番茄植株高度的正向调控因子.酵母双杂交文库筛选发现转录因子S1SPL3与S1WDR204具有相互作用,S1WDR204与S1SPL3可能共同调控番茄植株的茎杆发育.该研究增加了对番茄WD40蛋白参与株高调控的认知.     

p53信号通路在MTB感染肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549中的免疫调控作用

【目的】探讨p53通路在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的免疫调控作用。【方法】将供试的p53基因过表达和干扰载体转染293T细胞,对其作用效果进行验证。利用脂质体分别转染p53基因过表达和干扰载体到AECⅡ细胞系A549中,建立p53基因过表达和干扰A549系模型细胞。用牛结核分枝杆菌减毒株(BCG)分别感染未经任何处理的A549细胞(感染对照组)及模型细胞,以未感染BCG的各类A549细胞为参照。以β-actin为内参基因,通过实时荧光定量PCR和Western blot来分析信号分子p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达,以及炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的mRNA表达情况。【结果】过表达载体plRES2-EGFP-p53 WT和干扰载体TP53-RNAi(2648)作用效果明显,成功建立了p53基因过表达和干扰的A549细胞模型。BCG感染的对照组、p53基因过表达组和干扰组的A549细胞中,p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达显著或极显著高于相应的BCG未感染组,其中p300表达与p53基因表达量呈正相关,NF-κB、TLR-4、TRAF6表达与p53基因表达量呈负相关;BCG感染可引起TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的显著表达,且与p53基因表达量呈负相关。【结论】BCG感染A549细胞时,p53信号通路中的p53协同p300来抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化及负调控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌,从而抵抗MTB的侵染。     

IL20RB、ATP6V0A1和STX10基因对PRRSV和PEDV的增殖作用

为了明确IL20RB、ATP6V0A1和STX10基因对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）和猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的增殖作用，利用CRISPR/Cas9技术在PK15-CD163-Cas9细胞和IPEC-J2-Cas9细胞（笔者所在实验室前期制备）中分别敲除这3个基因，用PRRSV感染基因敲除的3种细胞（PK15-CD163-Cas9-ATP6V0A1、PK15-CD163-Cas9-IL20RB和PK15-CD163-Cas9-STX10），荧光定量PCR检测PRRSV的ORF7基因表达水平，分析PRRSV增殖情况；用PEDV感染基因敲除的3种细胞（IPEC-J2-Cas9-ATP6V0A1、IPEC-J2-Cas9-IL20RB和IPEC-J2-Cas9-STX10），荧光定量PCR检测PEDV的N蛋白基因表达水平，分析PEDV增殖情况。结果显示，在3个基因分别被敲除的PK15-CD163-Cas9-ATP6...     

异源β-Casein基因启动子调控下的t-PA cDNA

β-酪蛋白(β-Casein)是哺乳动物乳汁中主要的蛋白质,其基因5＇侧翼调控区常作为乳腺定位表达的调控序列.表达载体pSVL-βr-PA和pSVL-βb-PA分别含有1.0kb的大鼠β-Casein和0.6kg的牛β-Casein基因调控序列及t-PAcDNA.采用基因直接注射方法将两种表达载体分别注入家兔乳腺中.溶圈试验结果显示,两种表达载体均能在兔乳腺细胞中得到表达,表达水平没有明显差异.     

干细胞标志分子在猪脐带组织中的表达

【目的】研究干细胞标志分子,如干细胞"干性"调控关键基因及胚胎阶段特异性抗原(Stage-specific embryonic antigen,SSEA)在猪脐带组织中的表达状况,为猪脐带来源细胞的利用提供参考。【方法】以猪脐带为研究材料,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化方法,分析干细胞"干性"调控关键基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex1以及SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4在猪脐带组织中的表达。【结果】RT-PCR分析显示,干细胞"干性"调控关键基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex1在所有猪脐带样品中阳性转录,但Nanog mRNA的相对表达量显著低于Oct4mRNA、Sox2mRNA和Rex1mRNA,而后三者之间无显著差异;免疫组化分析显示,Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4在猪脐带组织中呈阳性染色,表达这些蛋白抗原的阳性细胞主要分布于脐带华通氏胶,且多集中于血管附近。【结论】从基因转录和蛋白水平证实猪脐带组织表达干细胞标志分子,SSEAs表达谱与猪胚胎生殖细胞相符,提示脐带组织中含有早期未分化的多潜能细胞。     

异源β-Casein基因启动子调控下的t-PAcDNA在兔乳腺中的暂性表达

β-酪蛋白 (β-Casein)是哺乳动物乳汁中主要的蛋白质 ,其基因 5′侧翼调控区常作为乳腺定位表达的调控序列。表达载体 p SVL-βr-PA和 p SVL-βb-PA分别含有 1 .0 kb的大鼠β-Casein和 0 .6kg的牛β-Casein基因调控序列及 t-PAc DNA。采用基因直接注射方法将两种表达载体分别注入家兔乳腺中。溶圈试验结果显示 ,两种表达载体均能在兔乳腺细胞中得到表达 ,表达水平没有明显差异     

猪CFL2b/荧光蛋白融合基因在小鼠成肌细胞中的表达与定位

[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-4的基因结构及表达调控研究

IGFBP-4是分子最小的IGFBP,它以糖基化和非糖基化两种形式存在于所有的生物流体中.表达IGFBP-4的细胞和组织极其广泛,并且其表达调控机制也因细胞类型不同而有所差异.本文主要是对IGFBP-4的基因组成、基因表达与调控、IGF-BP-4蛋白结构与功能的关系进行了综述.     

H3K4me3对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响

哺乳动物卵母细胞的成熟与组蛋白甲基化修饰密切相关. CPI-455是一种组蛋白去甲基化酶抑制剂,可特异性抑制组蛋白去甲基转移酶KDM5A/B的活性,提高H3K4me3(组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化)的表达水平.本实验在猪卵母细胞体外成熟过程中添加CPI-455,探究H3K4me3组蛋白甲基化对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响.首先,用不同浓度CPI-455在不同时间处理猪卵母细胞,发现在0～22 h添加5μmol CPI-455的处理方法效果最佳,卵母细胞成熟率与囊胚形成率均显著高于未处理组(p0.05). 0～22 h添加5μmol CPI-455处理卵母细胞显著提高了囊胚中H3K4me3的表达(p0.05),降低了卵母细胞中KDM5A和KDM5B的表达(p0.05),并且显著提高了囊胚中Nanog,Oct4,CDX2等多能性基因的表达(p0.05). CPI-455处理可以通过降低卵母细胞中相关基因的表达,上调囊胚中多能性基因的表达,调控H3K4me3的甲基化水平,从而促进猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育.     

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。     

基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响

【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。     

利用CRISPR/Cas9技术构建猪的LDLR基因敲除细胞

利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因LDLR敲除细胞：根据NCBI数据库猪LDLR基因(Gene ID为396801)序列设计sg RNA靶位点，构建敲除打靶载体，通过电转染猪胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得细胞克隆，进行PCR扩增和T载体克隆测序，经序列比对计算基因敲除效率。结果表明，依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则，在LDLR基因第一外显子上设计1条sg RNA，测序结果显示靶序列已正确连接，转染、筛选后共获得30个单细胞克隆，23个测序成功，其中有7个细胞克隆为LDLR基因敲除细胞克隆，敲除效率为30.4%。     

葡萄醛脱氢酶（ALDH2）基因进化、表达及启动子功能的生物信息学分析

【目的】研究葡萄醛脱氢酶ALDH2基因家族中ALDH2B4、ALDH2B8和ALDH2B9 3个成员的进化关系,对其在病原菌侵染、非生物胁迫及激素处理下的表达进行分析,为揭示ALDH2基因在植物逆境胁迫下的作用机理提供理论依据。【方法】运用生物信息学方法,鉴定葡萄ALDH蛋白序列;通过葡萄和拟南芥ALDH2基因的系统发育树、基因结构及同线性分析探讨其进化关系;利用葡萄Affymetrix芯片数据,分析葡萄ALDH2（ALDH2B4、ALDH2B8和ALDH2B9）基因在病原菌侵染、非生物胁迫和激素处理下的表达谱;采用在线软件PlantCARE分析3个葡萄ALDH2基因的启动子元件组成差异。【结果】在葡萄基因组中共鉴定出23个ALDH基因,并发现了ALDH2基因的可变剪接现象。基因结构分析结果表明,3个葡萄ALDH2基因的内含子/外显子组成高度相似,且均是通过大规模基因倍增产生的;仅有ALDH2B4具有剪接变体。葡萄与拟南芥的ALDH2基因位于同线区域,表明葡萄与拟南芥的ALDH2基因具有共同的祖先,ALDH2基因先于植物分化而存在。表达分析结果表明,VvALDH2B8是一个多病原菌和非生物胁迫响应基因,VvALDH2B4是一个渗透胁迫响应基因。葡萄的3个ALDH2基因的启动子区域均含有逆境胁迫响应元件,在VvALDH2B8上还发现了病原菌侵染响应元件Box-W1。【结论】葡萄的3个ALDH2基因虽然具有共同的祖先,但其在逆境条件下的表达差异很大,VvALDH2B8和VvALDH2B4可能在植物抵抗逆境胁迫中起重要作用。     

利用SRY基因鉴定山羊胎儿成纤维细胞的性别

根据GenBank中已发表的山羊SRY基因和β-乳球蛋白基因序列设计2对PCR引物,对来自3个1月龄山羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA进行PCR扩增,分别以公羊、母羊的基因组DNA为阳性和阴性对照,同时对PCR产物进行序列测定和同源性分析。结果表明,阳性对照和GFF1细胞系有2条扩增带,阴性对照、GFF2和GFF3细胞系只有1条扩增带;序列测定结果表明,PCR扩增产物为SRY基因,利用该方法准确鉴定出1个雄性细胞系和2个雌性细胞系。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

猪IFN-β和IRF-3基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立猪IFN-β及IRF-3基因实时荧光定量PCR检测方法,依据GenBank中IFN-β和IRF-3基因的保守序列,设计并合成各自特异性引物,并以β-actin为内参基因,采用SYBR Green-Ⅰ为染料,建立实时荧光定量检测方法。提取猪肺泡巨噬细胞总RNA,经反转录得cDNA,用特异性引物经PCR扩增得到IFN-β和IRF-3基因,将其克隆至pMD-19T载体,经测序鉴定后得重组质粒,依次10倍稀释做为标准品,建立标准曲线及溶解曲线。结果表明,β-actin基因、IFN-β基因和IRF-3基因标准曲线线性关系较好,R2≥0.997;溶解曲线为特异性单峰,无非特异性扩增,检测下限可达100个拷贝/μL。建立的猪IFN-β和IRF-3基因实时荧光定量RT-PCR检测方法,特异性强、重复性好,为从分子水平上研究猪的免疫应答奠定了基础。     

猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用

【目的】克隆猪L-Myc基因,并在蛋白水平表达的情况下探索其在细胞重编程中的作用,为深入研究猪L-Myc基因替代c-Myc诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）奠定基础。【方法】先通过NCBI序列比对,采用RT-PCR克隆猪L-Myc基因cDNA,生物信息学分析猪L-Myc基因与人和小鼠的同源性,构建融合表达载体pEGFP/L-Myc-C1,通过载体转染和免疫印记检测猪L-Myc基因cDNA的蛋白水平表达;再将L-Myc基因装入逆转录病毒载体中,分别使用不同的转录因子诱导猪胎儿成纤维细胞（porcine embryo fibroblast,PEF）,通过形态变化和碱性磷酸酶（AP）染色验证猪L-Myc基因在细胞重编程中的作用。【结果】①获得了1 113 bp的猪L-Myc基因cDNA,编码364个氨基酸,理论分子质量为40 kD;②生物信息学分析显示猪L-Myc基因与人和小鼠高度同源;③免疫印记检测结果说明猪L-Myc基因cDNA能够在蛋白水平表达;④细胞诱导试验和AP染色结果显示转录因子Oct4、Sox2、Klf4和L-Myc（OSKL）组合诱导的细胞阳性克隆率明显高于Oct4、Sox2和Klf4（OSK）组合的阳性克隆率。【结论】获得了猪L-Myc基因,并且该基因在蛋白水平表达且在细胞重编程过程中起到了重要的作用。     

猪伪狂犬病病毒豫A株、豫B株PK基因的克隆和序列比较分析

对来自河南省的两份疑似伪狂犬的病料进行了PrvPK基因的PCR扩增,将两份扩增产物分别克隆于pMD18-T载体,对重组质粒作PCR、酶切分析和序列测定,证实了克隆片段的特异性。借助生物学分析软件,将YuA株和YuB株PK基因的核苷酸序列与已被Genebank收录的PryMinA株、PryEr株、NIA-3株及Ka株的PK基因核苷酸序列进行同源性和差异性比较,六个Prv毒株PK基因核苷酸序列间具有很高的同源性,最低者为YuA株和Ka株,其同源性为97．1％;YuA株在282位比其它毒株少一个G,导致缺失突变,93位以后氨基酸序列的同源性大大降低,该毒株与MinA株、YuB株、Er株、Nia-3和Ka株同源性分别降为30．7％、30．7％、30．2％、29．5％和19．5％,明显低于其它组间的最低值86．1％,分离毒对家兔的不致病性可能与该位点的缺失突变有一定关系。以NiA-3株为标准,在其238至249位有一个高变区,在1081至1098位有一个高变区,这两个高变区没有打乱读码框,也没有破坏PK激酶的保守氨基酸位点,推测这两个区域对于PK激酶结构的稳定性和功能的发挥是非必需的。