同翅目害虫对吡虫啉抗性研究进展

吡虫啉是第一个新烟碱类杀虫剂,于1991年面市。吡虫啉对防治同翅目害虫(蚜虫、粉虱、飞虱)和部分鞘翅目害虫(甲虫)及其抗性种群有特效。但随着吡虫啉的大量应用,很多害虫产生了抗药性问题。就同翅目害虫对吡虫啉的抗性发生概况、交互抗性、抗性机理以及抗性治理的研究进展作了综述。     

斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。     

星豹蛛细胞色素CYP3001U15基因克隆与生物信息学分析

星豹蛛是农业害虫的重要捕食性天敌。通过转录组测序鉴定出66条星豹蛛细胞色素P450基因,进一步筛选分析出5条基因,预测其与外源物质代谢有关。为进一步研究星豹蛛细胞色素P450功能和代谢机制,选取其中一条基因进行生物信息学研究。试验通过RT-PCR扩增技术,将星豹蛛总RNA反转录cDNA,后以此为模板进行PCR扩增,回收纯化产物完成单克隆并测序,获取该基因序列信息,并对其进行生物信息学分析。结果发现,克隆到CYP3001U15基因ORF序列,该基因开放阅读框为1 074 bp,编码357个氨基酸,分子质量为42 ku,等电点为5.91,原子总数为5 808,分子式为C₁₈₇₇H₂₈₉₆N₄₉₄O₅₃₁S₁₀;正电荷残基47个,占氨基酸总数的13.2%,负电荷残基52个,占氨基酸总数的14.6%;蛋白的二级结构预测结果显示,α螺旋占47.62%,β折叠占8.96%,β转角占4.76%,无规则卷曲占38.66%;亚细胞定位预测结果显示,其定位在细胞内质网上;蛋白信号肽预测结果显示,该...     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

昆虫细胞色素P450的研究进展及其介导的抗药性

昆虫细胞色素P450在昆虫抗药性、解毒代谢等方面具有重大研究价值.概述了昆虫细胞色素P450在昆虫抗药性中所起的作用及其目前的一些研究进展,分析了其基因的结构和特点,从结构决定功能这个角度阐述了该酶的功能、表达及其诱导机制,从分子学角度分析了昆虫细胞色素P450介导昆虫抗药性的分子机制.     

金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因的克隆及表达

【目的】克隆并鉴定金纹细蛾(Phyllonorycter ringoniella)细胞色素CYP6家族基因,并观察氯氟氰菊酯药剂处理后mRNA相对表达量的变化,为金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因全长cDNA的获得,以及防止或延缓金纹细蛾抗药性的产生提供理论依据。【方法】以GenBank上公布的CYP6家族基因编码区序列为基础设计并合成简并引物;利用RT-PCR扩增获得序列后在NCBI上进行Blastx对比,根据P450基因命名法进行命名并向GenBank提交序列获得登录号;利用点滴法和qRT-PCR技术,将金纹细蛾3龄幼虫在氯氟氰菊酯(LC50=12.88mg/L)条件下处理24h后,观察其体内细胞色素P450基因的相对表达量。【结果】成功扩增出3个长度分别为415,412和421bp的cDNA片段。同源性分析表明,3条基因序列与CYP6AN5、CYP6B5和CYP6ab氨基酸相似性分别达61%,59%和71%,可将其初步均归类为CYP6家族,并分别命名为phCYP6AN5、phCYP6B5和phCYP6ab,将序列信息提交至GenBank,获得GenBank登录号分别为KJ559411、KJ559412和KJ559413。药剂处理对3种基因发生了不同的诱导或抑制作用,phCYP6AN5基因在受到药剂处理后相对表达量显著上升,而phCYP6B5和phCYP6ab在受到药剂处理后相对表达量显著下降。【结论】成功获得3条金纹细蛾细胞色素CYP6家族基因片段;诱导剂的诱导作用存在一定程度的特异性,对某种或几种P450酶有效应的化合物并不一定诱导其他类型的P450。     

灰飞虱共生真菌P450过量表达介导的吡虫啉抗药性

昆虫共生菌广泛参与寄主昆虫抗药性的形成,但对其抗性产生的分子机制的研究相对较少.本研究首先在室内敏感品系基础上建立了灰飞虱抗、感吡虫啉品系,利用现有灰飞虱转录组数据库,序列验证并定量分析了15条灰飞虱共生真菌P450基因,与敏感品系相比,发现其中10条P450基因在吡虫啉抗性品系中显著过量表达(LsSFP450-2、L...     

南昌地区斜纹夜蛾种群的抗性水平及与两种解毒酶的关系

采用生测与生物化学的方法测定了南昌地区斜纹夜蛾种群对多类杀虫剂的抗性水平及其体内两种解毒酶(细胞色素P450单加氧酶与酯酶)的活性。结果表明,江西南昌地区的斜纹夜蛾田间种群对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了高水平的抗性,对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂产生了中等水平的抗性,而对氟虫腈、阿维菌素和氟铃脲等药剂尚未产生明显抗性。与敏感品系相比,南昌地区斜纹夜蛾种群的细胞色素P450单加氧酶和酯酶活性都有明显的提高。     

二化螟两种P450基因CYP4M38和CYP4M39的时空表达分析

细胞色素P450在昆虫对外源物质代谢中发挥重要作用,是昆虫重要的解毒酶系。CYP4家族是昆虫细胞色素P450基因家族中的重要分支,与昆虫的解毒代谢密切相关。为初步明确CYP4家族基因在二化螟中的表达信息,本文测定分析了二化螟两种P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39的序列同源性及时空表达谱,序列同源性分析发现CsCYP4M38与烟草天蛾MsCYP4M2氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达56.86%;CsCYP4M39与烟草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达59.96%,构建系统发育树显示,CsCYP4M38与CsCYP4M39属于CYP4家族,且分别与MsCYP4M2和MsCYP4M1进化距离较近;时空表达谱测定结果表明,两种基因在不同发育阶段和不同组织中的表达存在差异性,CsCYP4M38在2龄幼虫、5龄幼虫及雌成虫内表达量相对较高,在1龄幼虫中表达量最低,CsCYP4M39在幼虫期表达量相对较高,且表达量随龄期增加呈现先上升后下降的趋势,在卵、蛹及成虫中表达量相对较低。CsCYP4M38和CsCYP4M39在脂肪体、中肠及表皮中的表达量相对较高,且均在脂肪体内的表达量最高。明确基因表达谱是研究其功能的基础,CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同阶段的表达量具有一定的变化性,说明这两种基因在二化螟不同发育历期中的功能不同,而两种基因均在脂肪体中表达量最高,这可能与脂肪体是昆虫的主要的解毒代谢场所有关。     

荭草提取物对大鼠CYP450酶的抑制作用评价

[目的]考察荭草提取物对大鼠肝微粒体CYP450中6种亚型酶的体外抑制作用,从而预测发生药物相互作用的可能性,为临床合理用药提供科学依据.[方法]在肝微粒体孵育体系中,将荭草提取物分别与混合探针底物(非那西丁/CYP1A2、氯唑沙宗/CYP2E1、右美沙芬/CYP2D4、奥美拉唑/CYP2C19、甲苯磺丁脲/CYP2C11、睾酮/CYP3A2)共同孵育,UPLC-MS/MS检测各探针底物的代谢物生成量,采用GraphPad v5.0软件计算半数抑制浓度(IC50).[结果]荭草提取物对大鼠肝微粒体中CYP1A2、CYP2E1、CYP2D4、CYP2C19、CYP2C11和CYP3A2的IC50值在85.75～345.00μg/mL.[结论]在临床剂量下,荭草提取物对大鼠肝微粒体CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用,对CYP1A2有强抑制作用.     

黑龙江省大豆蚜抗药性研究

2009年在黑龙江省3个有代表性大豆产区采集大豆蚜,用浸叶法分别对有机磷、氨基甲酸酯类等10种化学药剂进行敏感度测定,得到大豆蚜对10种药剂的LC50值和相对毒力指数,发现三地大豆蚜对有机磷类农药已产生了轻微的抗性,对阿维菌素和高氯两类药剂最敏感.     

大豆蚜羧酸酯酶基因AgCarE的克隆、表达及活性分析

【目的】克隆大豆蚜羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究大豆蚜抗药性机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术,克隆了1个大豆蚜羧酸酯酶基因的全长cDNA序列,命名为AgCarE,利用生物信息学软件及网上工具进行序列分析,以pET-21b为载体构建原核表达系统进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因AgCarE（GenBank登录号：JF970181）全长1 946 bp,编码526个氨基酸。羧酸酯酶AgCarE的等电点（pI）为6.08,蛋白活性中心包括3个氨基酸残基（催化三联体）：Ser186、Glu313、His434,5个N-联糖基化位点,具备羧酸酯酶的结构特征,属羧酸酯酶家族（EC: 3.1.1.-）。将该基因编码序列与pET-21b载体重组,经IPTG诱导表达HIS标签融合蛋白、SDS-PAGE分析和Western-blot检测,在大肠杆菌BL21中成功表达约59 kD的AgCarE蛋白,以α-醋酸萘酯为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为0.036 mmol/100 μL酶液。【结论】成功克隆、表达了大豆蚜羧酸酯酶蛋白AgCarE,以α-醋酸萘酯为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为0.036 mmol/100 μL酶液,有助于进一步了解羧酸酯酶的结构特征及水解作用,为设计研发新型杀虫剂提供可能。     

大豆植株形态对大豆蚜寄生和天敌捕食的影响

试验研究了大豆植株形态对大豆蚜的寄生和天敌捕食的影响。结果表明：大豆所表现的抗蚜性与其植株形态有关。裸大豆2个品种,大豆蚜10d增殖倍数分别为20．00和32．87;有茸毛大豆3个品种,大豆蚜10d增殖倍数分别为17．78,23．44和13．50。24h连续观察异色瓢虫对大豆蚜的影响,在捕食者的数量和发育阶段相同的情况下,瓢虫幼虫捕食量在裸大豆植株上为6．5头／h,在有茸毛大豆上为3．6头／h。     

河北邢台和江苏南京地区棉蚜对丁硫克百威和吡虫啉的抗性

【目的】对河北邢台和江苏南京地区棉蚜（Aphis gossypii Glover）进行抗性监测,了解棉蚜对丁硫克百威和吡虫啉的抗性发展情况,为抗性治理提供理论依据。【方法】以用药水平最低的新疆南疆种群作为相对敏感种群,通过室内毒力测定、离体酶活力测定、相对表达量分析,研究新疆南疆、河北邢台及江苏南京3个地区棉蚜对丁硫克百威和吡虫啉潜在的代谢抗性机制。【结果】河北邢台和江苏南京地区的棉蚜对丁硫克百威仍处于敏感阶段;但对吡虫啉的抗性已有所发展,抗性水平分别为4.87和8.72倍,为低水平抗性阶段。解毒代谢酶活力对比研究发现,3个地区田间种群之间多功能氧化酶、酯酶及谷胱甘肽转移酶的活力均存在显著差异,江苏南京种群的酯酶活力显著高于新疆南疆种群。定量PCR分析表明,河北邢台地区棉蚜的羧酸酯酶表达量较高,是新疆种群棉蚜的3.28倍。【结论】田间棉蚜已对吡虫啉产生了低水平的抗性,酯酶活力升高在棉蚜对吡虫啉低水平抗性形成中发挥作用。     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

青蒿CYP71AV1和CPR基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建

采用RT-PCR方法从青蒿中克隆紫槐二烯氧化酶基因和细胞色素P450还原酶基因编码区序列,正向插入经改造后获得的双元三价植物高效表达载体p1304*中,构建植物表达载体p1304*-CPR-CYP71AV1,并将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404,获得可直接用于遗传改良青蒿的工程菌p1304*-CPR-CYP71AV1-LBA4404,为利用植物基因工程技术提高青蒿素产量奠定了基础.     

拟南芥CYP76C2基因(At2g45570)的克隆及其菌核病抗性功能分析

以拟南芥基因组DNA为模板,扩增出细胞色素P450(CYP76C2)基因的ORF,成功构建了CYP76C2基因的过表达载体并获得转基因植株.通过离体和活体接种表明,CYP76C2基因的过表达植株对核盘菌的抗性增强.