黄瓜CsAP2基因克隆及表达模式

本研究利用同源克隆方法从黄瓜(Cucumis sativus L.)顶芽中克隆获得APETALA2 (AP2)同源基因Cs AP2的cDNA序列。序列分析表明,CsAP2基因c DNA序列的完整开放阅读框(ORF)为1 452 bp,编码483个氨基酸,其分子质量为53 359,理论等电点为5.59。多序列比对和系统进化分析表明,CsAP2位于A类基因AP2分支,包含两个保守的AP2结构域。CsAP2与甜瓜CmAP2的同源性最高,为97.7%。CsAP2定位在细胞核。实时荧光定量PCR显示,CsAP2基因在营养器官中和四轮花器官中均有表达。     

大豆MIKC型MADS-box基因家族分析

根据拟南芥的MIKC型MADS-box蛋白序列构建HMM(hidden markov model)模型,在大豆基因组中确定了57个MIKC型MADS-box同源基因.分子进化树分析表明,57个大豆MIKC型MADS-box基因分为14个亚类,而MIKC*型基因又分为两个进化支.控制花形态建成的ABCDE同源异型基因(如API,AG,AP3和PI等)和重要的控制开花时间的基因(如SVP和SOC1)在大豆基因组中表现出多拷贝的特征.MEME和SMART分析表明,大豆和拟南芥MIKC型MADS-box基因具有保守的MADS和K-box基序,还有一些亚类具有特异的基序.MIKC型MADS-box基因结构较为保守,多数基因具有7～8个外显子.本研究得到的MIKC型MADS-box基因为下一步研究大豆花形态建成和开花时间调控的分子机制提供了重要参考依据.     

春兰AGAMOUS同源基因的克隆及表达分析

为深入探索春兰(Cymbidium goeringii)中C类MADS-box基因参与春兰花器官发育调控的分子机理,用同源克隆的方法从春兰花芽中分离出两个C类MADS-box基因CygoAG1与CygoAG2。在分析其序列结构的基础上,分别检测2者在春兰不同花器官中的表达差异。序列结构分析表明:CygoAG1序列全长为831bp,包含702 bp完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码233个氨基酸和1个终止密码子;CygoAG2基因cDNA序列全长996 bp,包含705 bp完整开放阅读框,编码234个氨基酸和1个终止密码子,2个基因编码的转录因子均包含保守的MADS、K-box结构域和AG基序。分子系统发生与进化树重建结果显示:春兰CygoAG1与CygoAG2与拟南芥MADS-box基因家族中AG (AGAMOUS)基因的同源性最高。实时荧光定量分析结果表明,春兰CygoAG1基因只在花粉团、合蕊柱和子房中表达,在其它花器官及营养器官叶片中不表达,其在子房中的表达量最高。CygoAG2基因在春兰的花器官如萼片、花瓣、唇瓣、花粉团、合蕊柱和子房中均有表达,但在营养器官叶片中不表达,其在合蕊柱(雌雄蕊合生结构)中的表达量最高。CygoAG1和CygoAG2基因在春兰花器官中的表达模式呈现一定的差异。     

向日葵PMADS2 LIKE基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因是调控花发育进程的关键转录因子。在向日葵中大量的花发育相关基因有待于发掘和鉴定。本研究以向日葵(Helianthus annuus)为材料克隆到了一个MADS-box新成员PMADS2 LIKE。序列分析结果显示该基因具有MADS-box家族典型的MIKC保守结构域;系统发育树分析发现该基因与拟南芥PI基因亲缘关系最近;q RT-PCR组织表达模式分析该基因仅在花和果实中表达,且在6个花器官中仅在雄蕊和花瓣表达;q RT-PCR定量分析表示该基因从开花前25 d一直表达到开花期,并且在开花前5 d表达量最高。研究结果表明,PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中具有一定的生物学功能。本研究的结果和推论为进一步探究向日葵PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中的生物学功能提供前期数据基础,为理清MADS-box基因在向日葵花发育中的调控网络提供线索。     

菠萝AcMADS14的克隆及其在成花转变中的表达分析

MIKC型MADS-box家族成员SVP参与植物开花时间和花发育的调控。本研究从‘巴厘’菠萝中克隆到成花抑制蛋白SVP亚家族的一个同源基因AcMADS14,其开放阅读框长度为897 bp,编码299个氨基酸。序列分析发现AcMADS14蛋白包含1个高度保守的MADS-box结构域和1个半保守的K-box结构域。系统进化分析表明AcMADS14蛋白序列与油棕EgSVP和椰子CnSVP具有较高的同源性。通过RT-qPCR分析组织特异性发现AcMADS14在叶片、根等营养器官中表达较高,在花分生组织、雄蕊和雌蕊等生殖器官中表达量较低;外源喷施乙烯利抑制了AcMADS14在花芽分化阶段的表达,特别是在花器官分化期表达量显著下降。此外,转录激活活性分析表明Ac MADS14蛋白具有转录激活活性,可激活或抑制下游靶基因。综上,AcMADS14可能响应乙烯处理在菠萝营养生长转变为生殖生长的过程中发挥抑制作用,为探究菠萝成花分子机制提供了理论基础。     

海南钻喙兰B类MADS-box基因的克隆与表达分析

为了更多的了解B类MADS-box基因对兰花花器官发育的调控机理,本研究通过设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术从海南钻喙兰(Rhynchostylis gigantea)中分离得到两个B类MADS-box基因。序列分析表明,两基因分别属于B类MADS-box基因的AP3和PI家族,命名为RgAP3和RgPI。RgAP3基因含有一个675bp的开放阅读框(ORF),编码225个氨基酸,RgPI基因含有一个633bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。表达分析显示,两基因仅在生殖器官中表达,而在营养器官中没有表达,其中RgPI在花器官的各个部分均有表达,而RgAP3仅在花瓣、萼片中有表达,而在花梗和子房中没有表达。     

甜荞FaesFUL4基因的克隆与表达分析

本研究采用同源克隆的方法,从甜荞(Fagopyrum esculentum Moench.)品种‘北早生’中分离出调控果实发育的FaesFUL4基因,该基因的cDNA序列全长795 bp,包含一个长为714 bp完整的开放阅读框,共编码237个氨基酸和1个终止密码子。分子系统发生分析和同源蛋白比对结果显示:FaesFUL4蛋白属于A类MADS-box基因家族AP1/SQUA亚家族的euFUL进化系,含有MADS、I、K和C末端四个明显的结构域,且C末端转录激活区含有2个保守的模体(Motif):FUL motif和paleoAP1 motif。基因表达的组织特异性分析表明:FaesFUL4基因主要在甜荞叶片、花序和果实中表达,在根和茎中有微量表达,其在花序中的相对表达量最高。进一步分析基因在果实不同发育时期的表达量发现,其在果实迅速膨大期表达量最高。因此推测该基因不但参与调控花器官的发育过程,且对于维持果实的正常发育具有重要作用。     

茄子(Solanum melongena)MADs-box家族基因SmA GL9的克隆与表达分析

本研究以茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2所构建的抑制差减文库(SSH)中差异表达的EST片段fan11为依据,利用RACE技术克隆得到一条与AGL9基因一致性达97.93%的cDNA序列,命名为SmA GL9。生物信息学分析表明,该基因有一个全长726 bp的开放阅读框,编码241个氨基酸,预测蛋白分子量为27.546 2 kD,理论等电点为9.00。保守结构域分析发现该蛋白含有MADS-MEF2-like和K-box两个保守结构域,属MADS-box转录因子。同源进化分析结果显示SmAGL9基因的蛋白质序列与辣椒AGL9基因同源关系相近。RT-qPCR分析表明,低温条件下SmAGL9基因在单性结实和非单性结实的子房和果实发育过程中均有表达,果实发育初期单性结实品系中的表达量显著高于非单性结实品系,推测SmAGL9基因在茄子单性结实子房和果实发育初期具有重要的调控作用。结果可为进一步研究茄子单性结实果实形成的分子机理提供参考。     

小麦花发育MADS-box基因的表达模式分析

为解析小麦花发育的分子机制,构建了MADS-box基因系统进化树,发现小麦中存在花发育ABCDE模型的各类基因。半定量RT-PCR和定量RT-PCR分析结果显示,A类基因AP1/FUL小麦中的同源基因TaFUL在所有花器官中都表达,在外稃和內稃中表达水平最高。B类基因TaAP3和C类基因TaAG的表达模式保守,TaAP3在浆片和雄蕊中表达,TaAG在雄蕊和雌蕊中表达。D类基因OsMADS13的同源基因除了在雌蕊表达外,在浆片也有较高的表达,暗示该基因可能同时影响胚珠和浆片的发育。E类基因TaSEP在内稃和内三轮器官表达,在外稃和护颖中不表达。LHS1是禾本科特有的MADS-box基因亚家族,发挥E类基因的功能。TaLHS1除了在內稃和外稃表达,在护颖中也有表达。水稻中控制心皮发育的DROOPING LEAF(DL)基因的同源基因TaDL除了在外稃和心皮表达外,在护颖中也有表达。根据这些结果,我们认为控制小麦花发育的分子机制比较保守,但部分基因功能在进化过程中可能发生了分化。另外,结合小麦外稃和护颖形态结构分析,TaLHS1以及TaDL的表达模式暗示小麦的护颖和外稃这两个器官可能有共同的起源。     

三白草APETALA1基因的克隆和在苞叶中的表达

三白草属于三白草科,其花没有花萼和花瓣,开花时顶端三片苞片变白。A-class MADS-box基因在花发育过程中起着重要作用。APETALA1(AP1)基因属于花分生组织识别基因,调控花分生组织向花器官的转变;同时AP1基因又是花器官形态特征基因,在花发育的ABCDE模型中,AP1基因属于A类基因,是萼片和花瓣正常发育所必需的。本研究通过RACE方法克隆三白草的MADS-box AP1基因的cDNA全长并与其他物种的AP1同源基因C-末端的结构域进行比较,同时对AP1 MADS-box基因在苞叶变化过程中表达进行分析,无被花三白草的研究对正确了解花被起源和演化过程具有重要的意义。     

棉花GhMADS7基因正调控棉花花瓣发育

MADS-box基因家族作为一类重要的转录因子,主要参与植物花器官的生长发育。GhMADS7/98具有保守的MADS-box及K结构域,属于AG亚家族MIKC~C型MADS-box基因。通过同源序列比对发现,GhMADS7/98与拟南芥AtAG (AT4G18960)基因的蛋白序列具有64%的同源性。组织表达分析表明, GhMADS7基因在花瓣、花药、柱头和胚珠等花器官组织中均有表达。为进一步研究该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,获得了表达量明显下调的转基因株系。表型观察发现,在干涉植株长度为5~6 mm和7~8 mm的花蕾中出现花瓣发育延缓的表型;通过对干涉系转基因植株花瓣进行石蜡切片观察发现,相较于野生型植株,干涉系植株花瓣中的维管束存在明显的收缩现象;通过qRT-PCR检测发现,转基因株系中控制花瓣发育的A、B类基因的表达量出现异常。因此推测GhMADS7在棉花花瓣发育过程中起着重要的作用。     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

一个绿竹MADS-box基因的克隆与序列分析

MADS-box基因编码的转录因子在植物花器官发育过程中起着重要作用.采用RT-PCR技术,从绿竹(Bambusa oldhamii L.)中分离到一个MADS-box基因,命名为BOMADS1(GenBank登记号:EF517293).BOMADS1编码区cDNA全长723 bp;编码区共编码240个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构,其编码肽链包含了MADS区、K区、Ⅰ区和C末端.序列分析结果表明,BOMADS1编码的蛋白与其它植物的MADS-box蛋白有着较高的一致性,其中与石刁柏(Asparagus officinalis L.)的AOM3高达87%.系统进化树分析表明BOMADS1基因属于E类功能基因.     

马尾松PmMADS13基因的克隆与表达分析

SOC1/TM3是MADS-box家族一员,它能介导多条开花途径的信号整合,从而调控开花的时间和花器官的发育。为了解SOC1类基因在马尾松生殖生长中的作用,从转录组测序结果中筛选到一条SOC1类同源基因,设计特异性引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得该基因的全长cDNA序列为1 147 bp,包括666 bp的开放阅读框(ORF),共编码220个氨基酸,命名为PmMADS13。氨基酸序列比对分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端具有高度保守的SOC1 motif基序;进化树分析表明马尾松PmMADS13与油松的DAL9基因、辐射松的MADS9基因、火炬松的MADS13基因的亲缘关系最近,属于SOC1/TM3亚家族;RT-PCR分析显示,PmMADS13在马尾松生殖器官雌花、雄花中均有高表达,其次是茎端和针叶,在根部组织中的表达量最低。推测PmMADS13是参与马尾松成花的重要基因。     

MADS-box基因在果实发育、成熟过程中的作用

MADS-box基因是一个序列特异的调节基因家族,所编码的蛋白为转录因子,主要由MADS盒、K盒、I区、C末端、N末端等5个部分组成,其中MADS盒非常保守。MADS-box转录因子是通过二聚体化的形式以其保守结构域与特定的DNA序列相结合来调控基因的表达的。大量的研究表明,MADS-box基因在植物花的发育上具有重要的作用,已克隆出了许多与花器官发育相关的A-C类的MADS-box基因,而且也发现了许多可以调控花时的MADS-box基因。目前,越来越多的研究表明,MADS-box基因在果实的发育、成熟中也有着重要的作用。已在矮牵牛和拟南芥中分离出与胚珠的发育密切相关的几个MADS-box基因FBP7、FBPII、STK、SHP及SEP基因。目前认为果实的成熟主要是由于乙烯的调控而引起的,但在番茄中发现1个MADS-box基因与果实的成熟相关,而且可能是跃变型和非跃变型果实共有的果实成熟调节者,首次发现MADS-box对果实成熟的作用会为用非激素的方法来调控果实成熟提供新途径。果实的开裂会严重影响某些裂果的产量,进行相关的分子调控有着重要的实际意义,已在拟南芥中发现2个MADS-box基因SHP和FUL与果实的开裂密切相关,SHP会控制裂开区域的分化,而FUL的过量表达会抑制裂片区域的木质化,FUL可以负调控SHP基因。     

斑茅cDNA中抗病基因同源序列的分离和表达特性分析

植物抗病基因具有一些特定的保守结构域。本研究根据已知植物同源抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗近缘植物斑茅的cDNA中扩增出6条抗病基因同源序列, 它们在NCBI上登录号分别为EU685835、EU685836、EU685837、EU685838、EU685839 和 EU685840。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因保守结构域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(Hydrophobic domain, HD)。氨基酸序列的同源性比对表明,6条RGAs序列同11条参试的抗病基因之间的同源性为8.3%~93%,而6条RGAs之间的氨基酸序列同源为30.5%~45.6%。另外,本实验所克隆的6条斑茅抗病基因同源序列中, kinase-2 (LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸,推测所克隆的NBS-LRR类抗病基因都属于non-TIR-NBS-LRR类。定量PCR分析表明, 6条斑茅抗病基因同源序列在根、茎和叶片中组成型表达,同时这些抗病基因同源序列的表达会受外源信号分子水杨酸和过氧化氢的上调作用,可能在斑茅的抗病性中具有一定的作用。     

牡丹花发育相关基因PsPI的克隆与表达分析

PI基因能够调控植物花器官形成。本研究以牡丹品种‘洛阳红’为研究材料,通过克隆从牡丹花瓣中得到PI同源基因,并利用q RT-PCR对其表达特性进行分析。结果表明,牡丹PI基因cDNA全长636 bp,包含MADS MEF domain,K-box domain,氨基酸序列C末端具有典型PI-motif I,命名为Ps PI,GenBank登录号为MH169595。序列比对与系统进化分析表明,牡丹Ps PI与芍药亲缘关系最近,相似性达90%以上。Ps PI在牡丹营养器官中痕量表达,生殖器官组织中的表达量较高,花瓣中表达量最高,为萼片32倍;牡丹花发育6个时期中,雄蕊、雌蕊原基分化期Ps PI表达量与其他4个时期存在显著差异,雌蕊原基分化期最高;4种不同花型牡丹的花器官中,Ps PI在花瓣中表达量高于萼片、雌蕊与雄蕊,单瓣型、荷花型牡丹表达量显著高于皇冠型与蔷薇型。Ps PI基因参与雌蕊、雄蕊原基分化,不同花型牡丹中该基因均在花瓣表现出较高的表达量,在雌蕊、雄蕊瓣化过程中可能具有关键作用,进而调控牡丹花器官的形态建成,该结果为牡丹花型分子育种提供了理论依据。     

铁皮石斛SEP基因克隆与表达的研究

随着植物中越来越多的MADS-box基因被克隆出来,对经典的ABC模型进一步进行完善,提出花发育的ABCE"四元体模型",其中SEP1、SEP2、SEP3、SEP4为E类基因,SEP1同源基因在花器官识别方面起着重要的作用.本研究以铁皮石斛花器官作为实验材料,用RACE方法快速克隆全长cDNA,生物信息学分析全长cDN...     

黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1克隆及表达分析

中国黄瓜品种繁多，但黄瓜的抗逆性不强，容易产生病虫害。因此，分析和验证抗病相关的基因，探究黄瓜抗病的分子机理，可为培育黄瓜抗性品种提供理论基础。本研究以黄瓜为试验材料，采用RT-PCR技术克隆了黄瓜铜伴侣蛋白基因CsATX1的cDNA序列全长，并对其进行生物信息学分析；采用荧光定量PCR的方法分析CsATX1基因在细菌性角斑病侵染0～96 h下的表达情况，以期探究其与黄瓜抗病性的关系。结果表明：CsATX1基因序列全长为768 bp，含有一个288 bp的ORF阅读框，可编码95个氨基酸，该基因编码蛋白的相对分子质量约为9.95 kD，理论等电点是5.07，为亲水性蛋白，不具有跨膜结构，不含信号肽序列。系统进化树分析表明Cs ATX1与葫芦科同源蛋白的亲缘关系最近。RT-qPCR分析表明，CsATX1在黄瓜叶中有表达，在黄瓜细菌性角斑病菌侵染下，该基因在黄瓜叶中表达显著增高，受黄瓜细菌性角斑病菌的诱导。该研究结果为深入探究CsATX1基因功能提供科学依据。     

萼脊兰MADS-box基因的克隆及表达载体构建

为了研究"ABC"模型的B类PI基因,探究决定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊兰花瓣总RNA,并通过RT-PCR法克隆萼脊兰PI基因的编码序列,该序列长度为633 bp,编码210个氨基酸,与小兰屿蝴蝶兰的氨基酸相似性最高。对PI所表达蛋白质的结构、亲水性和二级结构进行了分析,结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守结构域,属于MADS-box基因家族;该蛋白分子属于亲水性蛋白,包含56.19%α螺旋、13.81%的延伸链以及30%的不规则折叠,实时荧光定量PCR结果显示,PI基因主要在花器官中表达,且表达量高,说明PI基因的表达具有组织特异性。构建植物表达载体的结果显示,目的基因和带启动子的片段已插入到表达载体p CAMBIA1301中,表明成功构建植物表达载体1301-PI,为最终获得新奇花型的萼脊兰奠定基础。