白斑综合征病毒感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) TRx、LvP38、CAT、POD基因的表达

为比较凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的氧化反应和信号转导相关基因在白斑综合征病毒(WSSV)感染中的变化情况,采用实时荧光定量PCR,分析WSSV感染凡纳滨对虾6、12、24、48、72 h后,鳃和类淋巴组织中硫氧还原蛋白(TRx)、p38信号通路(LvP38)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)在mRNA转录水平的变化。结果显示,感染对虾的类淋巴组织中,TRx、LvP38、CAT、POD在72 h时表达量最高,与对照组差异显著(P<0.05);而在鳃组织中,该4种基因在12 h时表达量最高,呈先升高后下降的趋势。推断TRx、LvP38、CAT、POD与WSSV感染密切相关     

凡纳滨对虾LvRab5B蛋白与IHHNV病毒蛋白的互作

为了探究LvRab5B蛋白在凡纳滨对虾抗病毒感染中的作用,实验分别构建了LvRab5B蛋白在昆虫和酵母细胞中的融合表达载体,将不同的载体导入不同的细胞中,利用免疫荧光和酵母双杂交的方法研究了Lv Rab5B蛋白在昆虫细胞中的表达以及Lv Rab5B蛋白与病毒IHHNV之间的互作关系;通过qRT-PCR方法研究了该蛋白在健康对虾不同组织中的表达情况以及凡纳滨对虾分别感染IHHNV和WSSV后不同时间点的相对表达量。结果显示,Lv Rab5B基因融合蛋白能够在昆虫细胞中表达;Lv Rab5B蛋白与IHHNV病毒衣壳蛋白CP无相互作用,而与非结构蛋白NS1相互作用明显,与非结构蛋白NS2作用较弱。qRT-PCR结果显示,LvRab5B基因在凡纳滨对虾心脏、鳃腺、肠道、胃、肝胰脏和肌肉中都表达,在肠道中表达量最高,肝胰脏次之;Lv Rab5B蛋白在凡纳滨对虾机体感染病毒前后的表达情况不同,感染初期表达降低,随后迅速上升,末期下降。研究表明,LvRab5B基因参与凡纳滨对虾抵抗IHHNV和WSSV病毒的先天免疫过程,为进一步研究Lv Rab5B蛋白在对虾机体中的免疫功能及作用机制奠定了基础。     

白斑综合征病毒感染对凡纳滨对虾热休克蛋白60和90表达的影响

采用实时荧光定量PCR技术分析白斑综合征病毒(WSSV)感染凡纳滨对虾不同时段鳃、肠、肝胰腺、肌肉、类淋巴和血细胞组织中热休克蛋白(HSP)60和90基因mRNA转录水平的变化。结果显示,HSP60和HSP90在这6个组织中都有表达,WSSV感染影响各组织中HSP60和HSP90 mRNA转录水平的表达,WSSV感染抑制HSP60在鳃、肠、肌肉和血细胞的表达,促进HSP90在鳃、肠、肝胰腺、肌肉、血细胞和类淋巴的表达,表明HSP60和HSP90参与WSSV感染免疫反应。     

毒死蜱胁迫下WSSV对凡纳滨对虾的致病性

为了评价养殖水环境中毒死蜱对凡纳滨对虾生存的危害性,开展了毒死蜱胁迫下白斑综合征病毒(WSSV)对凡纳滨对虾致死实验,分析了毒死蜱胁迫下凡纳滨对虾鳃组织WSSV含量和肌肉组织乙酰胆碱酯酶活性变化。通过急性毒性实验测定了毒死蜱对凡纳滨对虾的半致死浓度(LC₅₀),随着暴露时间的延长,LC₅₀值显著下降,存在着浓度-反应的正向关系,96 h LC₅₀为0.758 μg/L(0.521～0.987 μg/L)。在此基础上,确定了毒死蜱胁迫实验浓度为0.2 μg/L,此浓度下药浴4 d后对凡纳滨对虾注射WSSV,结果显示:毒死蜱胁迫下注射WSSV组的对虾死亡率(83.33?Ee4.7%)极显著高于乙醇-WSSV组(40.00?Ee0.9%);对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示:感染72 h后,毒死蜱-WSSV组WSSV含量约是乙醇-WSSV组的4倍;感染96 h后,毒死蜱-WSSV组WSSV含量显著增加,约是72 h毒死蜱-WSSV组的4.9倍,是96 h乙醇-WSSV组的5.9倍。毒死蜱胁迫下,对虾肌肉组织乙酰胆碱酯酶(AchE)活性低于对照组20%左右。由此可见,毒死蜱胁迫下,WSSV增殖速率加快,导致对虾死亡率升高。     

凡纳滨对虾AP-1基因的克隆和表达特征分析

为了探讨凡纳滨对虾转录因子AP-1在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾AP-1基因(LvAP-1,GenBank注册号:KF999956),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,AP-1基因ORF区全长882 bp,编码293个氨基酸。预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个Jun结构域和1个高度保守的亮氨酸拉链结构域(bZIP),其中Jun结构域在非脊椎动物中保守性不高。组织表达分析表明,该基因在凡纳滨对虾各组织中广泛表达,其中在血细胞中表达量最高。在WSSV感染早期(0.5 hpi),该基因表达没有显著改变,感染后5 h(5 hpi),AP-1基因开始显著上调表达,在人工感染后24 h,该基因的表达量达到最高(P0.01)。研究表明,该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,为进一步研究LvAP-1在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

氨氮胁迫下白斑综合征病毒对凡纳滨对虾的致病性

为了评价养殖水环境中氨氮(NH_4-N)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的危害性,开展了NH_4-N胁迫对凡纳滨对虾感染白斑综合征病毒(WSSV)后的死亡率、WSSV增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响的实验。在NH_4-N胁迫质量浓度为15.6 mg·L-1,分别注射2×105和2×106个WSSV粒子,结果显示,NH_4-N胁迫下注射2×105个WSSV粒子的凡纳滨对虾第144小时死亡率达到53.3%,显著高于无胁迫组(40.0%)。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,NH_4-N胁迫下凡纳滨对虾鳃组织内WSSV的增殖加快。此外,免疫相关酶活性结果显示,NH_4-N浓度突变会促使对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性短暂升高后持续降低。由此可见,NH_4-N胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内的增殖,导致更高死亡率,这可能是因为胁迫造成了对虾免疫相关酶活性降低和抗病原感染能力下降。     

氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV的影响

为了评价养殖水环境中氨氮和亚硝基氮对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的危害性,开展了氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV后的死亡率、WSSV在患病对虾体内增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响的研究。实验设置氨氮(NH+4)和亚硝基氮(NO-2)的共同胁迫浓度均为20 mg·L-1,分别注射10-4和10-5稀释度的WSSV提取液。结果显示,胁迫下感染10-4WSSV的凡纳滨对虾144 h死亡率达到100%,显著高于无胁迫组(76.67%),相同实验条件下高浓度病毒感染组死亡率高于低浓度组。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,氨氮和亚硝基氮共同胁迫下凡纳滨对虾体内WSSV的增殖加快,感染48 h后胁迫组病毒量是无胁迫组的1.6倍,72 h时病毒量达到无胁迫组的2.0~3.7倍。此外,免疫相关酶活性结果显示,氨氮和亚硝基氮浓度突变会促使对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性先短暂升高然后降低。由此可见,氨氮和亚硝基氮共同胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内的增殖,导致更高死亡率,这可能是因为胁迫造成了对虾免疫相关酶活性的降低和抗病原感染能力下降所致。     

凡纳滨对虾JAK和STAT基因在苏云金芽孢杆菌侵染过程中的表达变化分析

为了分析凡纳滨对虾JAK(Lv-JAK)和STAT(Lv-STAT)基因应答病原菌侵染的表达变化特征,本实验利用半定量PCR技术分析了Lv-JAK和Lv-STAT基因的组织表达特征,并利用实时荧光定量PCR技术分析了其在苏云金芽孢杆菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-JAK和Lv-STAT基因在凡纳滨对虾的9种组织中有不同程度的表达,均在鳃、肠道和心脏中表达量较高。苏云金芽孢杆菌感染后,在鳃组织中,Lv-JAK和Lv-STAT基因的相对表达量在感染的中晚期(24~72 h)显著上调表达;在肠道组织中,Lv-JAK基因的相对表达量在感染后的6和24 h显著上调,Lv-STAT基因的相对表达量在感染后的24和72 h显著上调。综上表明,JAK和STAT基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由苏云金芽孢杆菌引发的天然免疫应答过程,探讨凡纳滨对虾JAK和STAT基因应答苏云金芽孢杆菌感染的表达变化特征,有助于研究对虾JAK/STAT通路在应答病原菌侵染过程中的功能和作用机制。     

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白VP110部分重组表达及其与对虾鳃细胞膜蛋白结合分析

将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。     

三疣梭子蟹Apaf-1基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用RACE方法克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)基因,该基因cDNA全长为2032 bp,其中,ORF为1050 bp,编码349个氨基酸,预测分子量为39.13 kDa,理论等电点为7.67。同源性和系统发育分析显示,Apaf-1与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) Apaf-1的同源性最高,为51.27%,并与凡纳滨对虾聚为一支。组织表达分析显示,Apaf-1基因的相对表达水平在肝胰脏最高,其次是肌肉、心脏、鳃和眼柄,血细胞和表皮最低。不同盐度胁迫后,Apaf-1在Ⅱ期幼蟹体内表达水平在3 h达到最大值,此后,呈先下降再上升趋势;Apaf-1在80日龄盐度20胁迫后三疣梭子蟹的鳃中呈上升趋势,在肝胰腺中为先上升后下降趋势,表明盐度改变能影响该基因在鳃和肝胰腺组织中的表达。不同病原感染实验结果显示,在血细胞中,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后Apaf-1的表达于48 h到达峰值,为对照组的2.76倍(P<0.05),注射白斑综合征病毒(WSSV)后,仅在12 h表达水平上调,为对照组的1.25倍(P<0.05);在肝胰腺中,注射副溶血弧菌后在72 h到达峰值,为对照组的5.44倍(P<0.05),注射WSSV后在12 h到达峰值,为对照组的5.89倍(P<0.05),整体呈上调表达趋势。本研究为进一步理解三疣梭子蟹Apaf-1基因的生理功能提供了参考。     

饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响

为了评估饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫灵敏性和平衡性的相关基因表达的影响,以鱼粉含量为24.5%的基础饲料(对照组)及在基础饲料中添加2.5%酵母提取物的实验饲料,分别饲喂凡纳滨对虾56 d,检测两种饲料投喂的对虾在急性感染溶藻弧菌前后鳃组织Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量变化及感染后的对虾死亡情况。结果表明:摄食添加酵母提取物饲料的凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量均显著高于对照组对虾(P0.05),IMD mRNA表达量与对照组无显著性差异(P0.05)。急性感染溶藻弧菌后,两组对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量随感染进程均出现显著变化,Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量峰值出现的时间分别为24、42和36 h,且摄食添加酵母提取物组对虾各基因的表达量峰值分别为对照组峰值的201.06%、481.46%和276.77%,均显著高于对照组对虾(P0.05)。摄食添加酵母提取物饲料组对虾鳃组织中Toll受体和IM D mRNA表达量在感染溶藻弧菌后12和24 h分别出现显著上调,而对照组对虾鳃组织中Toll受体和IMD mRNA表达量分别在感染弧菌后24和42 h才出现显著上调。两组对虾经溶藻弧菌人工急性感染后72 h内的累积死亡率无显著差异(P0.05)。实验表明,饲料中添加酵母提取物上调了溶藻弧菌感染前凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的表达量,提早了溶藻弧菌感染后对虾Toll受体和IMD mRNA表达量上调时间,且增加了对虾Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量的峰值,在一定程度上提高了凡纳滨对虾免疫相关基因表达的灵敏性。     

聚β-羟基丁酸酯对凡纳滨对虾抗WSSV 能力及免疫基因表达量的影响

本实验采用单因子浓度梯度法,以添加不同质量分数(0.0%,0.5%,1.0%,2.5%,5.0%,10.0%)聚β-羟基丁酸酯(PHB)的人工配合饲料饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)20 d后,对其进行白斑综合症病毒(WSSV)感染测试;利用实时荧光定量PCR技术分析PHB对凡纳滨对虾抵御WSSV侵染能力的影响,并选择最高免疫保护率(RPS)组进行不同时间点基因表达量分析。研究发现,PHB对感染WSSV对虾的存活率无显著影响(P0.05);但感染WSSV的对虾平均存活时间随PHB浓度上升呈现先上升后下降再上升的趋势,饲喂PHB对虾的平均存活时间均高于对照组,其中1.0%PHB浓度组对虾平均存活时间最长,且显著高于空白对照组及5.0%PHB浓度组(P0.05)。分析各组对虾体内病毒含量,发现1.0%PHB浓度组对虾病毒含量在实验前期显著低于对照组(P0.05)。对虾感染WSSV后,对对照组及1.0%PHB实验组对虾前48 h内6个采样时间点的超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、溶菌酶(lzm)及抗菌肽(abp)5个基因进行表达趋势分析,结果表明基因表达趋势在两组间无显著区别;投喂PHB的对虾在感染WSSV后血淋巴中sod、cat、gsh-px和lzm表达量呈现上升后下降再上升的趋势且分别在6 h、6 h、3 h、6 h达到最大值;abp在WSSV感染3 h内急速下降,随后在12 h达到最大值后又下降;另外饲喂PHB对虾体内免疫基因表达量均高于对照组。结果说明,PHB能够提高凡纳滨对虾对WSSV的抵抗力,且在一定程度上提高了对虾的免疫力。     

凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子基因的克隆及表达分析

为研究酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating factor,PPAF)在凡纳滨对虾感染传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)过程中所起的免疫作用,实验采用逆转录聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增技术克隆了凡纳滨对虾PPAF基因的全长cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR技术分析了该基因在正常凡纳滨对虾和感染IHHNV凡纳滨对虾不同组织的表达情况。结果显示,克隆获得了1 986 bp凡纳滨对虾PPAF基因cDNA全长序列(GenBank登录号JQ684529),其中含有一个1 629 bp开放阅读框(ORF),两翼分别存在21 bp(5'端)和336 bp(3'端)的非翻译区。该基因的开放阅读框共编码542个氨基酸,氨基酸序列269~517处存在功能结构域——丝氨酸蛋白酶结构域,氨基酸序列494~502区域存在一个ALPHA-2巨球型免疫蛋白功能位点,316~321区域有一个组氨酸酶活性位点;定量PCR分析发现,该基因无论在正常对虾还是感染IHHNV对虾的心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量均较低,在血液和鳃腺中的表达量明显高于其他组织,但感染IHHNV对虾不同组织中PPAF基因的表达量均低于正常对虾相应组织中的表达量。定量检测PPAF基因在对虾鳃腺组织中的表达情况显示,对虾感染IHHNV后,PPAF基因的表达量急剧降低,3 h时至最低,之后表达量逐渐上升,48h时达最高值。研究表明,IHHNV可抑制PPAF基因的表达,因而抑制酚氧化酶原免疫系统的有效激活,或是其感染对虾并在对虾组织内增殖的原因之一。     

凡纳滨对虾易位子相关蛋白α亚基(TRAPα)基因解析及其与WSSV抗性的关联

本研究旨在探讨凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)易位子相关蛋白 α 亚基(translocon-associated protein alpha, TRAPα)基因特征及其在抗白斑综合征病毒(white spot syndrome, WSSV)中的作用。通过 PCR 和 Sanger 测序技术, 获得凡纳滨对虾 TRAPα 的开放阅读框(open reading frame, ORF)序列, 将该基因命名为 Lv-trapα, 并进行生物信息学分析。采用 real-time PCR 分析 Lv-trapα 基因在健康凡纳滨对虾和感染 WSSV 不同时间点的凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、 肌肉、眼柄中的 Lv-trapα 表达水平。同时, 利用重亚硫酸氢盐测序技术(bisulfite sequencing PCR, BSP)检测健康凡纳滨对虾和感染 WSSV 后 96 h 的凡纳滨对虾肝胰腺组织中 Lv-trapα 基因上游 DNA 序列的甲基化水平。结果显示, Lv-trapα 的 ORF 全长 873 bp, 共编码 290 个氨基酸, 预测相对分子质量为 32466.4, 理论等电点为 4.45。多序列比对发现 TRAPα 蛋白的保守性较高。Lv-trapα DNA 序列中有 8 个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism, SNP), 其中 1 个 SNP 位点处于外显子区域且属于错义突变, 其余 7 个 SNP 位点处于内含子区域。real-time PCR 结果显示, Lv-trapα 基因在凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄中均有表达, 且在感染 WSSV 后显著上调表达(P＜0.05)。 值得注意的是, 在感染 WSSV 后 96 h, 体内病毒含量不同的凡纳滨对虾肝胰腺中 Lv-trapα 的表达水平差异显著, 高病毒含量组中 Lv-trapα 的表达水平显著高于低病毒含量组(P＜0.05), 提示 Lv-trapα 表达水平和 WSSV 复制水平存在正相关性。BSP 结果显示, Lv-trapα 基因上游 1 个 CpG 位点(存在于 NCBI 数据库 NW_020872863.1 第 360336-360337 nt 位置)的甲基化水平和 Lv-trapα 表达水平呈负相关, 该 CpG 位点的甲基化水平和凡纳滨对虾体内 WSSV 病毒含量也呈负相关。本研究可为深入研究凡纳滨对虾抗 WSSV 的分子机制和抗病分子育种提供理论参考。     

2株消化道优势菌对凡纳滨对虾免疫酶活性和抗白斑综合征病毒感染力的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,在基础饲料中分别添加从健康对虾消化道中分离纯化的优势菌菌株——美人鱼发光杆菌PC463和坚强芽孢杆菌PC465(菌含量≥1011CFU/g)的活菌和破碎菌各1 g/kg,观察其对凡纳滨对虾血淋巴免疫酶活性和抗WSSV感染保护率的影响。经过20 d养殖实验后发现,与对照组相比,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫实验,其凡纳滨对虾血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在不同程度上有所提高,并显著高于对照组(P<0.05)。WSSV感染后饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组存活率(53%±12%)和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组存活率(49%±15%)显著高于对照组(P<0.05)。结果表明:饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌和美人鱼发光杆菌灭活菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾免疫酶活性和抗WSSV感染能力,上述有防病作用的益生菌株以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产,可望成为对虾白斑病生物防治的有效途径之一。     

口服特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫保护效果

为探讨特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫保护机制及效果,本研究以添加不同剂量WSSV卵黄抗体制剂(0、0.2%和0.5%)的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,免疫28 d后使用WSSV进行人工感染,测定感染对虾的肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,以及感染后14 d内对虾的存活率。结果显示,WSSV感染3 d后,与未添加卵黄抗体制剂的对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活力显著升高,酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力显著降低,热休克蛋白70基因(Hsp70)表达水平显著升高,凝集素基因(lectin)和β-1,3-葡聚糖结合蛋白–脂蛋白基因(β-GBP-HDL)表达水平显著降低;0.5%免疫组对虾肝胰腺的SOD活力显著升高,ACP和AKP活力显著降低,Hsp70基因表达水平显著升高,β-GBP-HDL基因表达水平显著降低。人工感染实验结果显示,WSSV感染14 d后,0.2%和0.5%免疫组对虾的存活率分别为48.89%和87.78%,均显著高于对照组(存活率为0),且0.5%免疫组对虾存活率显著高于0.2%免疫组。特异性卵黄抗体制剂能在一定程度上改变发病的进程,延迟对虾的发病和死亡时间,提高同期存活率。研究表明,口服特异性卵黄抗体制剂可以调节对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。本研究为卵黄抗体抗WSSV感染机制的研究提供了参考,也为在生产上使用卵黄抗体防控WSSV感染提供了科学依据。     

凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子 基因(Lv-SOCS)的克隆及特征分析

为了探讨凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子(SOCS)在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,本实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾的SOCS基因(Lv-SOCS,GenBank注册号:KJ000426),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-SOCS的ORF区1 191 bp,编码397个氨基酸,预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个SH2结构域和1个SOCS-box结构域,组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肠道和肝胰腺中表达。在WSSV感染后中晚期(6~48 hpi),Lv-SOCS可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,上述结果为进一步研究Lv-SOCS基因在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

红景天提取物对凡纳滨对虾抗氧化系统及抗低盐度胁迫的影响

为研究红景天(Rhodiola rosea)提取物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗氧化系统及抵抗低盐度胁迫的影响,该实验设计0 mg·kg~(-1)、300 mg·kg~(-1)、1 000 mg·kg~(-1)和3 000 mg·kg~(-1) 4个红景天提取物水平饵料添加量,饲喂凡纳滨对虾28 d。然后进行72 h低盐度(10)胁迫实验,测试凡纳滨对虾肝胰腺总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及GSH-Px、CAT基因表达水平。结果显示,在天然海水养殖条件下,GSH-Px、CAT活性和GSH-Px基因表达水平在某些时段被显著诱导(P0.05)。低盐度胁迫24 h,对照组抗氧化指标相比于其他各组的变化幅度最大。低盐度胁迫72 h,红景天组T-AOC、CAT活性和GSH-Px、CAT基因表达水平均显著高于对照组(P0.05)。双因素方差分析结果显示红景天提取物添加量与时间的交互效应对抗氧化指标的影响显著。结果表明,红景天提取物能够有效缓解胁迫初期凡纳滨对虾抗氧化指标的剧烈改变,明显提高胁迫后期机体的抗氧化系统功能,具有成为抗应激饲料添加剂的潜力。     

微囊藻毒素对凡纳滨对虾肝胰腺氧化损伤研究

在水温(22±1)℃、pH 8.0～8.5、溶解氧7～8 mg/L下,对体质量(16.0±1.0) g凡纳滨对虾注射浓度为3.52×10^-4 mmol/kg的微囊藻毒素20μL。分别于注射后0、2、4、8、16、24、48、72 h测定凡纳滨对虾死亡率,并取肝胰腺组织,检测其超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶3种抗氧化酶活性及丙二醛含量的变化,研究微囊藻毒素对凡纳滨对虾肝胰腺相关免疫酶活性的影响。试验结果显示：注射微囊藻毒素后,凡纳滨对虾72 h死亡率为13.33%;凡纳滨对虾肝胰腺中丙二醛含量逐渐升高,8 h后显著高于对照组,并于72 h达到最大值(4.02±0.02) nmol/mg(P<0.05);超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性在72 h内均呈先升后降的趋势,并分别在2、4、8 h达到最高,随后活性逐渐降低,16 h后逐渐低于对照组,且活性均于72 h达到最低值。试验结果表明,微囊藻毒素导致凡纳滨对虾肝胰腺脂质过氧化反应逐渐增强并抑制凡纳滨对虾抗氧化相关酶活性,造成氧化应激,72 h内便会造成肝胰腺严重氧化损伤。