不同方法诱导鸡IL-2基因转录及cDNA克隆的研究

应用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导的鸡胚和成鸡脾脏及成鸡白细胞中提取的总RNA中扩增得到鸡白介素-2(IL-2)基因cDNA。结果表明：以50倍或100倍稀释度接种鸡胚48h提取脾脏总RNA扩增效果最好；以5倍或10倍免疫剂量免疫成鸡48-72h，提取脾细胞或血液白细胞总RNA扩增效果最佳。为进一步研究鸡IL-2基因分子生物学特性提供了简便的诱导方法。     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡胚IFN-y基因转录及cDNA克隆的研究

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从鸡新城疫系Ⅰ系疫苗接种的洛阳土种鸡胚脾提取的RNA中扩增到干扰素-γ(IFN-γ)基因cDNA。结果表明，以1：50或1：100稀释度接种后第48h提取的mRNA扩增效果最佳。序列测定显示，所克隆的洛阳土种鸡IFN-γ基因cDNA与所报道的鸡IFN-γ基因cDNA同源性为99．7％，相应的氨基酸序列同源性为100％，说明鸡IFN-γ基因编码区高度保守。     

新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞中免疫相关细胞因子表达的检测

分别采用新城疫强毒株F48E9与新城疫弱毒株La Sota感染10日龄鸡胚制作的鸡胚成纤维细胞,感染后24 h提取鸡胚成纤维细胞的总RNA,通过RT-PCR技术结合凝胶成像系统扫描检测21种免疫相关细胞因子在鸡胚成纤维细胞中的表达量.实验结果表明,在鸡胚成纤维细胞中,无论是否感染新城疫病毒,IL-2、IL-3、IL-4、IL-21不能检测到其相应条带.通过统计学分析,IFN-β、IFN-γ、IL-9、IL-12-P35、IL-12-P40在病毒感染组与对照组间呈现出显著的差异,而强毒感染组与弱毒感染组的比较中,仅IFNγ、IL-9表现出显著差异.     

绵羊脾脏淋巴细胞体外诱导培养及总RNA提取

本试验进行了绵羊脾脏淋巴细胞的分离、体外诱导培养和总RNA提取,经琼脂糖凝胶电泳证实为完整、均一的总RNA;将此法提取的RNA反转录成cDNA后经过PCR扩增,可获得清晰的目的条带。该方法简便、快速,提取的总RNA可以用于进一步基因克隆、表达。     

鸡Toll样受体在IBDV免疫中的作用研究

为了揭示鸡先天性免疫反应在IBDV疫苗过程中的作用,将40只14日海兰褐蛋鸡随机分成两组,实验组接种IBDV活疫苗,对照组注射生理盐水,隔离饲养。于免疫前和免疫后12h、24h、48h、72h、130h各取脾脏和法氏囊分离淋巴细胞并提取总RNA,用实时荧光定量检测方法检测各组中chTLR3、chTLR7、chTLR21表达的动态变化。结果显示,在免疫后36h,鸡法氏囊和脾脏中chTLR3表达变化最显著,在免疫后48h,鸡脾脏和法氏囊中chTLR21表达变化也较为明显。提示chTLR3在鸡对IBDV的免疫应答中起主要作用。     

鸡白介素-17 cDNA基因的克隆、序列分析及表达

用RT-PCR方法,分别以ConA体外刺激培养12、24、48 h的鸡脾脏淋巴细胞(SP)和经人工感染2次堆型艾美尔球虫(E im eria tenella)孢子化卵囊(约3.6×104个/鸡)的鸡盲肠扁桃体/肠上皮淋巴细胞(IELS)总RNA为模板,成功扩增出预计大小的鸡白介素-17 cDNA基因,并克隆入pM D 18-T载体,进行序列测定。测序结果显示其阅读框(ORF)为507 bp,与G enB ank上鸡IL-17基因已知序列(A J493595)BLA ST的比较表明:核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.4%和82.4%。将cDNA基因克隆入pET-32a质粒,构建了pET 32a-IL-17原核表达载体,IPTG诱导后表达出的融合蛋白大小为36 000左右。     

新城疫病毒F48E9感染CEF细胞特异性表达基因的筛选鉴定

分别以NDV F48E9和La Sota株感染鸡胚成纤维细胞,于感染后8 h提取NDV感染CEF细胞总RNA,通过mRNA差异显示技术筛选病毒感染诱导表达的特异性基因.主要方法是先以锚定引物经反转录后,然后以9～10 bp随机引物为上游引物,以锚定引物Oligod(T)18为下游引物,进行PCR扩增,PCR产物采用8%的尿素变性PAGE胶电泳进行分离鉴定.对于特征性差异带进行第二次PCR扩增,克隆后测定其核苷酸序列.结果我们发现数个差异条带,选取差异带在500 bp以内的条带,经测序后显示经NDV F48E9感染后,有一条差异条带特异性表达的基因所编码的蛋白与Receptor(TNFRSF)-interacting serine-threonine kinase 2有47 %同源,是一个新基因,其蛋白功能不明确,有可能和细胞的凋亡有关.     

鸡白细胞介素-15基因克隆、序列分析及表达

根据GenBank上发表的鸡IL-15基因序列设计两对引物,以从鸡脾脏中提取的基因组RNA为模板,采用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-15基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸡白细胞介素-15基因序列全长580bp,开放阅读框架内564个核苷酸共编码188个氨基酸。所扩增的序列与已报道的序列同源性为99.9%(563/564)。将扩增序列插入大肠杆菌载体pBV220中进行表达,SDS-PAGE显示目的蛋白约为21ku,表达产物经免疫荧光鉴定为阳性。     

鸡脾脏转移因子的理化性质鉴定及对肉仔鸡应用效果的研究

本文对山东莘县金鑫畜禽有限公司研发提取的鸡脾脏TF进行理化性质鉴定、增强鸡体免疫功能和生产性能、体内外抗病毒及体外抗菌试验。结果表明,该鸡脾脏TF主要成分为多肽,理化性质鉴定、无菌试验和安全试验结果均符合脾脏TF质量标准,在鸡胚和BHK细胞上有一定的抗病毒效果,直接抗菌作用不明显。临床药效试验表明该TF可以显著提高肉鸡的生产性能和免疫机能。     

鸡脾细胞总RNA的提取及其VH、VL基因的扩增

由鸡脾脏淋巴细胞中提取总RNA，反围录合成cDNA第一链，以cDNA为模板，根据鸡抗体VH、VL基因中的5’端和J端序列，设计并合成体外扩增VH、VL基因的两对引物，进行RT-PCR，成功地扩增出VH、VL基因片段。为鸡源ScFv噬菌体库的构建打下基础。     

ALV-J感染对鸡脾脏巨噬细胞天然免疫因子的影响

为探究J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）对鸡脾脏巨噬细胞天然免疫反应的影响,试验利用密度梯度离心法和贴壁法,从鸡脾脏组织中分离得到单核细胞,并通过显微镜观察培养至24 h、72 h、120 h单核细胞的分化过程;通过PCR扩增ALV-J特异性引物H5/H7,验证脾脏巨噬细胞对ALV-J的易感情况;同时,通过qPCR验证感染ALV-J后鸡原代脾脏巨噬细胞中炎性因子、干扰素及肿瘤抑制因子的表达。结果显示：单核细胞分化至第120 h形成形态正常的巨噬细胞,通过流式细胞技术检测鸡巨噬细胞表面特异性标记蛋白发现,84.9%的细胞为KUL01阳性细胞;鸡原代脾脏巨噬细胞对ALV-J易感,并且ALV-J可整合进鸡原代脾脏巨噬细胞基因组中;对感染ALV-J的鸡脾脏巨噬细胞进行形态观察,发现ALV-J感染导致鸡脾脏巨噬细胞形态逐渐萎缩直至死亡;ALV-J感染6 h、12 h、24 h及48 h可诱导鸡原代脾脏巨噬细胞炎性因子（IL-1β、IL-6）的表达显著上调,在ALV-J感染24 h、48 h诱导肿瘤抑制因子（TNF-α）的表达显著上调（...     

鸡肿瘤坏死因子α基因片段的分子克隆及序列测定

应用LPS诱生的鸡培养白细胞提取总RNA,参考几种动物的TNFα保守序列设计一对引物,以提取的培养白细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增目的基因片段,将PCR产物与PUC19连接,转化到大肠杆菌DH52进行分子克隆,对提取的重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定,表明重组的基因片段是目的基因片段,其长度为576bp。     

鸡胚接种鸡白介素18重组质粒对IBDVDNA疫苗免疫增强作用的研究

用鸡白细胞介素18(ChIL-18)重组质粒(pCI-ChIL-18)接种18胚龄SPF鸡胚,利用适时荧光定量PCR方法对试验鸡不同时间点的动态变化进行检测.检测结果表明,胚胎接种pCI-ChIL-18使ChIL-18在鸡血液中早期持续高浓度存在,能促进鸡脾脏和法氏囊中ChIL-18基因的大量表达.用pCI-ChIL-18与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫18胚龄SPF鸡胚,设1日龄雏鸡肌肉免疫对照组和空白对照组,2周龄时二免,6周龄时用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.结果表明,胚胎免疫pCI-ChIL-18能显著促进试验鸡T、B淋巴细胞的早期增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的早期抗体水平及其对强毒攻击的保护力.并进一步证明胚胎免疫pCI-ChIL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的早期免疫效果具有显著的增强作用(P相似文献   

海兰鸡IL-18全基因的克隆与序列分析

IL-18是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计一对引物,经植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后,提取其总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行了T-A克隆、测序,获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp,与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

应用SMART cDNA合成技术富集鸡脾脏微量RNA

以鸡脾脏中提取的20 ng微量RNA为起始样本,应用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链及扩增第二链,并在原有基础上做了适当的优化和改进.同时与传统cDNA合成方法进行了比较.最终,从20 ng总RNA中成功扩增出双链cDNA 6.03 μg,而采用传统方法只合成出0.03 μg cDNA,且前者cDNA的质量和纯度明显高于后者.结果表明,通过SMART cDNA合成技术,可使鸡脾脏微量RNA得到有效地富集.     

鸡白介素17A的克隆表达及活性测定

从经人工感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊(1×104个/只鸡)的盲肠上皮间淋巴细胞(IELs)提取总RNA,用RT-PCR方法成功扩增了鸡白介素17A(IL-17A)基因,测序结果显示,开放阅读框为453bp,编码150个氨基酸,与GenBank上鸡IL-17A基因(AM773756)的核苷酸和氨基酸序列完全一致(100%),与报道的哺乳动物IL-17A的氨基酸相似性达37%～46%。构建的pGEX-6p1-chIL-17A原核表达载体经1mmol/L IPTG诱导后表达出43kDa左右的融合蛋白,与预期大小一致,且Western-blot鉴定表达产物为目的蛋白。功能试验表明,表达的重组鸡IL-17A能够刺激鸡胚成纤维细胞产生IL-6。这些结果表明,鸡IL-17A在结构和功能方面与哺乳动物的IL-17A都有一定的相似性,可能在鸡的免疫应答过程中起到重要的作用。     

鸡γ-干扰素基因的克隆及其在原核和真核系统中的表达

应用一步法逆转录—聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术对罗曼蛋鸡γ_干扰素基因 (CHIFN_γ)进行了扩增。试验结果表明 ,在植物血凝素 (PHA) 5 0 0 μg/mL、细胞浓度 2 .5× 1 0 6/mL、诱导 1 0h,能从外周血淋巴细胞和脾淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段。将RT_PCR产物克隆到PGEM_Teasy载体 ,经过限制性酶切分析、测序证实克隆到的CHIFN_γ基因正确 ,命名为PGEM_CHIFN_γ。序列分析表明 ,CHIFN_γ基因与已发表的鸡IFN_γ基因的同源性为 95 .6%～ 1 0 0 % ,氨基酸水平同源性为 92 .8%～ 1 0 0 % ,与鸭IFN_γ核苷酸同源性为 67.5 %。将CHIFN_γ基因克隆到原核表达载体pGEX_6P_1的GST基因的下游 ,经IPTG诱导后表达出了 43kD的融合蛋白 ,超声波裂解后发现融合蛋白主要以包涵体的形式存在 ,裂解上清无抑制病毒活性 ;然而将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,通过脂质体转染COS_1细胞 ,用鼠抗CHIFN_γ高免血清进行间接免疫荧光试验 (IFA) ,结果表明在COS_1细胞的细胞膜和胞浆内均有CHIFN_γ表达 ,且细胞病变抑制试验证实 ,转染后细胞培养上清有干扰素活性 ,在鸡胚成纤维细胞 (CEF)上抑制VSV病毒的效价可达到 1 0 2 4U/ml。这些结果表明真核表达系统对CHIFN_γ基因表达产物的活性有重要影响。     

鸡胚血液中PGCs的分离及原代培养

在鸡胚孵化48,50,54,56,60h的不同时期，分离血液中原始生殖细胞（PGCs)，分离前的浓度分别为0.011%,0.007%,0.006%,0.006%,0.004%,0.001%,分离后的浓度分别为0.245,1.21%,1.02%,0.64%,0.27%,孵化48－54h，血液中PGCs浓度差异不显著，但孵化48h的鸡胚液较少，PGCs绝对量较低。孵化52－54h的鸡胚血液量较大，获取PGCs的绝对值较高，故分离PGCs的时间以孵化52－54h为宜，鸡胚血液中PGCs在未中任何外源生长因子而含10％FCS的TCM－199培养基中体外培养，能够存活3－4d。     

马立克氏病病毒MEQ基因真核表达载体的构建及对CEF细胞错配修复相关基因表达的影响

MEQ基因是马立克氏病病毒(MOV)血清1型特异性基因,为了研究MEQ基因的致瘤机理,本研究构建了MEQ基因的真核表达载体。首先采用TA克隆将MEQ基因片段连接p MD19-T,构建成p MD19-T-meq,然后采用Eco RⅠ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切将MEQ基因克隆至p VAX-1真核表达质粒,构建p VAX-1-meq真核表达质粒。提取p VAX-1-meq质粒转染至鸡胚成纤维细胞中,转染后提取贴壁细胞中总RNA,以β-actin作为内参采用Real-time PCR检测MEQ基因、错配修复相关基因、p53基因的m RNA表达情况。结果成功构建出p VAX1-meq真核表达载体,并在鸡胚成纤维细胞中成功表达。MEQ基因转染的鸡胚成纤维细胞中错配修复相关基因(MSH2和MLH1基因)、p53基因的m RNA表达量显著上调。表明MDV感染造成宿主DNA损伤后,MEQ基因影响DNA损伤修复相关基因的表达,干扰宿主对损伤的DNA进行修复,导致肿瘤的形成。     

鸡胚成纤维细胞的冷冻保存

试验研究了不同的冷冻保护液、不同的平衡方法对鸡胚成纤维细胞活力的影响及细胞复苏后的培养情况。结果表明,冷冻保护液Ⅰ和冷冻保护液Ⅱ对细胞的保护效果差异不显著(P>0 05),冷冻保护液Ⅲ对细胞的保护效果优于冷冻保护液Ⅰ和冷冻保护液Ⅱ,并且差异极显著(P<0 01);平衡方法Ⅰ和平衡方法Ⅱ对细胞的存活率影响差异不显著(P>0 05)。复苏后的鸡胚成纤维细胞于体外培养时存在贴壁迟缓,前期生长速度较慢等现象。