母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪感染PCV-3的影响

为了解猪圆环病毒3型病毒(porcine circovirus 3 virus, PCV-3)ORF2基因的分子生物学信息,探寻防控PCV-3损害仔猪的可行方案。本研究通过对山西省某未免疫过PCV-2商品疫苗的规模化母猪场的妊娠母猪在产前45 d持续6批次免疫PCV-2疫苗,以所生仔猪生产成绩和PCV-3 ORF2基因阳性检出率为指标,评价母猪免疫PCV-2疫苗对仔猪PCV-3的感染和发病情况的缓解作用。临床数据显示母猪免疫PCV-2疫苗后生产的6批仔猪PCV-3 ORF2基因阳性率由45.0%逐渐降至20.0%,伤亡率由25.5%降至8.0%。试验结果显示,从死亡仔猪淋巴结分离出的6株PCV-3 ORF2基因序列同源性为98.4%～99.2%,均有17个磷酸化位点,预测Cap蛋白氨基酸N端不存在典型的信号肽结构,说明该蛋白位于胞外区的可能性更大,且未预测到跨膜结构存在;PCV-3 ORF2与PCV-2a同源性为32.5%～32.9%,与PCV-2b同源性为30.8%～31.7%,与PCV-2d同源性为32.6%～33.5%,与PCV-4同源性为33.9%～34.3%,说明同源性低,进...     

猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析

为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

2020年猪圆环病毒2型云南流行株的分子鉴定及全基因组序列分析

为了弄清云南省猪圆环病毒2型(PCV-2)的流行和基因变异情况,试验采用PCR鉴定、PCV-2全基因扩增及克隆、PCV-2蛋白氨基酸比对与遗传进化分析、PCV-2 Cap蛋白氨基酸比对分析、PCV-2 Cap蛋白抗原指数预测分析等方法进行研究。结果表明,从43份样品中检测出5份阳性样品,其阳性率为11.63%;成功获得5个大小为1 768 bp的PCV-2全基因序列,分别将其命名为YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5;获得的5株毒株与国内外毒株氨基酸之间存在差异,同源性在66.8%～99.1%之间;5株PCV-2 ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸与5株疫苗株也存在多处氨基酸变异;其中YN PCV2-4 Cap蛋白抗原指数与5株疫苗株的Cap蛋白抗原指数差异性不大,而YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5的Cap蛋白抗原指数与5株疫苗株的Cap蛋白抗原指数差异性较大,在5～10,25,40～50,70,172～176,210～223区域的抗原指数均不同于疫苗株。说明云南省流行的猪圆环病...     

猪圆环病毒2型感染的血清学调查与分析

2004年1月～2005年12月我们用国产ELISA试剂盒,对湖北省部分规模猪场猪圆环病毒2型抗体进行了检测,共检测1816份血清,阳性402份,阳性率22.14%。其中哺乳仔猪148份,全部阴性,断奶仔猪733份,阳性82份,阳性率11.19%,肥育猪145份,阳性46份,阳性率31.72%,后备母猪310份,阳性72份,阳性率23.23%,经产母猪480份,阳性202份,阳性率42.08%。共检测猪场97个,血清学阳性猪场66个,占68.04%。对43份PCV-2阳性和94份PCV-2阴性的PRRS未免血清进行PRRSV病原学检测,PRRSV感染率分别为72.09%、12.77%,表明PCV-2感染会加剧猪群PRRSV感染;对77份PCV-2阳性和114份PCV-2阴性的PRRS已免血清进行免疫抗体检测,PRRS免疫合格率分别为32.17%、72.81%,表明PCV-2感染对PRRSV的免疫应答有明显的抑制作用。     

河北部分地区猪圆环病毒2型ELISA检测与分析

为分析河北部分地区不同猪场、不同阶段猪圆环病毒病2型(PCV-2)的感染情况。采集血清样品248份,采用PCV抗体诊断试剂盒(PCV-2-ELISA)检测其抗体水平及其阳性率。结果显示,采集的248份血清样品中,PCV-2抗体阳性216份,阳性率为87.1%,其中断奶仔猪PCV-2抗体阳性率为93.9%,后备猪PCV-2抗体阳性率88.0%,经产母猪PCV-2抗体阳性率84.1%;1～3胎母猪PCV-2抗体阳性率最高,分别为94.1%、91.3%、90.9%;4～6胎母猪PCV-2抗体阳性率分别为87.9%、84.2%、75.0%。该地区PCV-2感染率较高,免疫效果较差,该研究为该地区的猪PCV-2的防控提供研究基础。     

猪圆环病毒2型ORF3蛋白的表达及抗原性鉴定

为研究猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF3蛋白的免疫活性,对其进行了表达及初步鉴定。根据NCBI上PCV-2ORF3的基因序列(FR823451)设计特异性引物,扩增后将其插入pET28a表达载体构建了重组表达质粒pET-PCV-2-ORF3,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达后用SDS-PAGE和免疫印迹进行了鉴定。随后又用圆环病毒野毒感染猪和重组ORF2免疫小鼠的阳性血清对表达蛋白的免疫原性进行了检测。结果表明,构建成功的pET-PCV-2-ORF3表达菌被诱导后能大量表达PCV-2 ORF3蛋白。ORF3表达蛋白能与圆环病毒野毒感染猪的阳性血清发生特异性反应,与重组疫苗免疫鼠的阳性血清不能发生反应,表明ORF3蛋白具有很好的免疫原性和反应原性,有望作为圆环病毒野毒感染检测的靶抗原。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

猪圆环病毒2型Cap 蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究

为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a( )中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化

目的：本研究基于原核表达系统表达猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）Cap蛋白。方法：PCV-2 ORF2基因编码的Cap蛋白含有能产生免疫反应的多个抗原表位,本研究针对Cap蛋白基因设计引物,去掉核定位信号肽的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,筛选重组菌并进行原核表达、鉴定及纯化。结果：纯化后的修饰Cap蛋白是能够与猪圆环病毒Ⅱ型的阳性血清发生特异性反应。结论：表达的重组修饰Cap蛋白可以作为标准抗原蛋白用于PCV-2的检测。     

鹦鹉喙羽症病毒Cap蛋白的原核表达与纯化

鹦鹉喙羽症病毒(PBFDV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,可引起多个品种鹦鹉的急性死亡或者羽毛脱落和喙变形。病毒基因组中的ORF1和ORF2分别编码病毒复制相关蛋白(Rep protein)和衣壳蛋白(Cap protein)。Cap蛋白是圆环病毒的主要结构蛋白,也是其主要的免疫保护性蛋白。本试验应用PCR技术选择性扩增PBFDV Cap蛋白抗原表位集中区域的基因片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中,诱导表达截短的Cap蛋白。SDS-PAGE及质谱鉴定结果显示,融合表达的CapT蛋白约45 kDa,切胶纯化后的蛋白浓度约1. 6 mg/mL。该Cap蛋白的成功获得为PBFDV治疗用阳性血清制备及亚单位疫苗的开发奠定了必要的物质基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

规模化猪场主要疫病病毒抗体水平的监测与分析

本调查旨在了解当前苏中地区规模化猪场猪瘟(Classic Swine Fever, CSF)、猪口蹄疫(Food and Mouth Disease, FMD)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)、猪圆环病毒(Porcine Circovirus, PCV)疫苗免疫水平。收集泰州、扬州、南通、盐城四个地区22家规模化猪场妊娠母猪(497份样品)和保育仔猪(1060份样品)血清,采用ELISA法对血清CSFV、FMDV、PRRSV和PCV-2抗体水平进行监测。结果显示妊娠母猪CSFV、FMDV、PRRSV和PCV-2平均血清抗体阳性率分别为83.70%、86.72%、85.11%和81.29%,保育仔猪CSFV、FMDV、PRRSV和PCV-2平均血清抗体阳性率分别为84.34%、92.08%、90%和72.17%,均超过我国强制性疫苗免疫抗体阳性率标准70%。从整个猪群来看,该地区使用的四类疫苗及免疫手段均能发挥较好的免疫保护作用。     

ELISA对猪场PCV-2血清抗体的检测

应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对三个猪场的89份血清样本进行猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)血清抗体的检测，本次检测PCV-2的总阳性率为2．24％。在甲猪场的48份血清中检出猪PCV-2阳性2份，4份可疑，阳性率为4.17％；而乙、丙两猪场的血清样本均呈阴性。结果表明：甲猪场可能有猪PCV-2的存在，而乙、丙两猪场尚处于未被猪圆环病毒污染的状态。     

免疫和非免疫猪场猪圆环病毒2型抗体及病毒检测分析

疫苗免疫是防控猪圆环病毒2型(PCV2)感染的重要措施,但在疫苗免疫猪场也存在PCV2感染的情况,为了探究免疫猪场出现病毒感染的可能原因,本研究对7个规模化疫苗免疫猪场和2个非疫苗免疫猪场共计262份血清样品进行PCV2抗体和病毒检测,分析比较疫苗免疫猪场和非免疫猪场PCV2分离株的全基因组序列,从基因差异方面探讨免疫猪场发生PCV2感染的可能机制。结果显示,免疫猪的平均血清抗体阳性率为65.17%(116/178),最高为88.89%(24/27),最低为26.67%(8/30),说明不同猪场存在较大差异;非免疫猪的平均抗体阳性率为15.48%(13/84),猪场PCV2阳性率为100.00%(2/2),说明检测的猪场均存在PCV2的感染。通过常规PCR从抗体阳性的6份猪血清中扩增到PCV2全基因组序列(2个来自免疫猪场,4个来自非免疫猪场)。基因分析发现,该6个PCV2毒株的基因组全长均为1 767bp;6个毒株之间Rep基因序列相似性为97.1%～99.8%,与GenBank中收录的国内外24个分离株之间的相似性为94.2%～100.0%,具有较高的保守性;6个毒株之间Cap基因序列相似性为82.7%～99.2%,与国内外24个分离株之间的同源性为78.5%～98.1%,Cap基因的变异程度较大。对免疫猪场分离株和非免疫猪场分离株全基因组序列的比对并未显示出显著性差异,说明这两类猪场感染的PCV2毒株并未出现明显的变异。结果表明,疫苗免疫在PCV2感染的防控中具有重要作用,免疫猪场出现病毒再次感染主要是各种原因造成的免疫失败所致,免疫猪场感染的PCV2毒株并未出现明显的变异,而对PCV2感染的防控中除了要做好疫苗的免疫接种外,良好的饲养管理和兽医卫生措施至关重要。     

杭州地区猪Ⅱ型圆环病毒抗体的血清学调查

从浙江省杭州地区28个猪场采集猪血清1677份，用间接荧光免疫试验进行了猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)抗体检测。共检出抗体阳性血清960份，总阳性率为57．25％，其中经产母猪的阳性率为62．32%，后备母猪的阳性率为55．55%，断奶后仔猪的阳性率为55．48%，断奶前仔猪的阳性率为52．98%。血清学调查结果显示，PCV-2在杭州地区猪场的感染较普遍。     

猪α干扰素对猪圆环病毒2型亚单位疫苗免疫效果的影响

为了评估酵母表达的PCV2 Cap蛋白在猪体的免疫特性以及猪α干扰素对其的免疫佐剂效果,将酵母表达的PCV2 Cap蛋白配比适量的铝胶或重组猪α干扰素制成亚单位疫苗.30日龄仔猪分别接种铝胶佐剂亚单位疫苗和猪α干扰素佐剂亚单位疫苗,同时设攻毒对照与空白对照,首免后21 d加强免疫,二免后14 d用PCV2 JS株攻毒.铝胶佐剂亚单位疫苗免疫猪体后产生了PCV2特异性中和抗体.猪α干扰素佐剂亚单位疫苗组仔猪免疫后产生的ELISA抗体和中和抗体都显著高于铝胶亚单位疫苗组仔猪.攻毒对照组的4只仔猪攻毒后全都产生了病毒血症,并有较长时间的发热;铝胶亚单位疫苗组4头仔猪中只有1头仔猪产生病毒血症,添加猪α干扰素亚单位疫苗组的仔猪攻毒后都没有产生病毒血症.综合分析试验猪的病毒感染、临床表现和生产性能等情况表明Cap蛋白亚单位疫苗具有免疫保护效果,猪α干扰素可显著增强Cap蛋白亚单位疫苗接种仔猪的体液免疫反应,提高PCV-2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护效果.     

对部分不明原因高热发病猪场的主要疫病调查报告

2007年以来广西一些猪场出现不明原因高热发病和死亡率的现象,为了解其病因,我们应用PCR和RT-PCR技术,对来源于8个发病猪场的89份病料进行猪瘟病毒(CsFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)猪伪狂犬病(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的调查.结果发现89份病料中检出CSFV阳性样品8份,阳性率8.99%,PRRSV阳性样品43份,阳性率48.31%;PRV阳性3份,阳性率3.37%,PCV-2阳性24份,阳性率26.97%;同时存在CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2不同程度的混合感染现象,其中PRRS和PCV-2混合感染最为严重,阳性率达7.87%.调查结果表明,我区部分不明原因高热的发病猪场均不同程度存在CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2感染的现象,特别是PRRSV感染情况极为严重,提示PRRSV可能是我区一些猪场出现不明原因高热发病死亡的主要原因.     

猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap.本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定.将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白.根据文献报道,致病性的PCV-2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX-6p-1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段.通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE结果,重组质粒pPRO-Cap和pPRO-Rep以及pGEX-△Cap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%.将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV-2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX-△Cap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV-2感染用候选抗原.     

合肥地区猪圆环病毒Ⅱ型血清学调查报告

用酶联免疫吸附试验(ELISA)对合肥市及周边地区4个万头以上猪场的220份血清样品进行猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)血清抗体的检测。检测结果表明,PCV-2血清学抗体的总阳性率为14.55%,种猪的阳性率为21.36%,4个猪场的血清学检测结果全部为阳性,但感染率有较大差别。     

华南地区猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测分析

为了解华南地区猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的最新流行情况,采集了华南地区11个规模猪场各饲养阶段猪血清807份,用套式PCR(nPCR)检测猪圆环病毒1型(PCV-1)和猪圆环病毒2型(PCV-2);采集了若干猪场2010年1月至2011年8月期间有咳嗽、喘气、消瘦及疑似PDNS等临床症状的猪血清312份,以及无临床症状猪血清104份,以nPCR检测PCV-2,以一步法反转录PCR(RT-PCR)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。结果发现,所调查的11个规模猪场中只有5个检出PCV-1,所有猪场均检出PCV-2。PCV-2阳性率为30.61%,而PCV-1阳性率仅为4.21%;经产母猪和7周龄以上保育猪PCV阳性率最高;有临床症状的猪血清PCV-2阳性率为58.65%,PRRSV阳性率为37.82%,PCV-2阳性猪群中有39.89%的猪同时感染PRRSV;有症状猪群7月～9月的PCV-2感染率最高,而1月～3月最低;无临床症状猪血清PCV-2阳性率为27.9%,PRRSV阳性率为0.96%,PCV-2与PRRSV无混合感染。证明PCV尤其是PCV-2在华南地区仍广泛传播并流行,而且PCV-2与PRRSV混合感染致病情况较多。PCV-2的感染率与季节有一定的相关性,种猪带毒情况严重。