猪瘟疫苗微载体悬浮培养生产工艺试验

为优化猪瘟病毒(CSFV)的BT细胞悬浮培养工艺以提高CSFV抗原含量,采用2 L生物反应器对BT细胞的最佳接种密度、CSFV的最佳接种剂量进行了摸索和优化,采用优化的工艺参数,进行了BT细胞5倍消化放大工艺验证,同时对比了BT细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺增殖CSFV的差异。结果表明,在3 g/L微载体浓度下,采用1.5×10~5个/mg的细胞初始接种密度,培养72 h可获得最佳细胞密度;采用MOI(感染复数)为0.5的接种剂量可收获≥106.8FAID_(50)/mL的CSFV抗原;BT细胞从2 L到10 L生物反应器的5倍消化放大工艺验证试验,3批细胞培养96 h均能达到4.0×10~6个/mL以上;悬浮培养工艺增殖的CSFV抗原含量约是转瓶培养工艺的15倍。以上试验为猪瘟疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

PK-15细胞微载体悬浮培养及PCV2增殖工艺研究

研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。     

微载体生物反应器按不同细胞密度培养猪圆环病毒2型的研究

本试验旨在探讨微载体生物反应器使用不同PK15细胞密度培养猪圆环病毒2型的效果,对比不同细胞密度培养出的抗原效价,从而选择最佳细胞密度培养猪圆环病毒2型,提升猪圆环病毒2型抗原效价。在生物反应器细胞上罐时分别按每个微载体20、30、40、50个细胞的细胞密度接种至4台相同的生物反应器罐中进行培养,每罐均按相同的条件培养,在分别培养4 h、24 h、48 h、96 h时取样观察细胞的生长状态并统计细胞密度,当大部分载体细胞脱落70%时收获抗原,并留样检测其抗原效价。结果显示:每个微载体40个细胞的细胞密度上罐培养的效果最好,表现在4 h时细胞贴附微载体较均匀,24 h时90%微载体长满单层细胞,48 h时细胞生长致密,细胞密度增长8倍,72 h时细胞增长7倍,最终收获抗原效价最高达到107.5TCID50/m L。结果表明:每个微载体40个细胞的接种密度上罐,培养效果最好,效价最高。因此,在微载体生物反应器上培养猪圆环病毒2型时,选择合适的细胞密度接种是保证培养高效价病毒的一个重要前提。     

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。     

草鱼出血病细胞培养灭活疫苗生产工艺的比较

比较了方瓶静置培养、１０×２００ｍｌ转管培养和细胞生物反应器微载体培养３种方法增殖细胞和病毒的效率,以细胞生物反应器微载体培养法的效率最高,与静置培养法相比较,单位培养液细胞增殖量提高２０～２５倍,病毒增殖量ＴＣＩＤ５０测定增加１．６５对数值,ＬＤ５０测定增加１．４５对数值。经济效益比较,疫苗制备的培养液成本,以细胞生物反应器微载体培养法最低。已研究出以细胞生物反应器微载体培养法增殖细胞和病毒为基本生产工艺的工厂化生产草鱼出血病细胞疫苗工艺流程。     

猪圆环病毒2型培养工艺研究

本文在猪圆环病毒2型转瓶培养工艺基础上,利用NBS生物反应器和无血清培养基进行PK15-B1细胞培养,增殖猪圆环病毒2型病毒液,探索简化PCV2病毒液生产工艺、降低生产成本的方法,为今后用生物反应器微载体系统生产PCV2病毒液提供了科学依据。     

猪圆环病毒2型在转管微载体培养PK-15细胞中增殖动态

为提高猪圆环病毒2型(PCV2)的增殖规模及单位体积内的病毒滴度,本研究利用转管微型反应器,采用荧光定量PCR检测方法,对PCV2在PK-15细胞中复制特性和增殖动态进行了系统研究。结果显示,转管(内置0.6 g纸片载体)中接种约2.98×107个DF-1细胞,培养7 d细胞增至1.93×108~2.0×108个,并确定培养7 d时为最佳接毒时间;病毒的最佳接种剂量为120.8 MOI,最佳收毒时间为接毒后的100 h,可达5.53E+06以上。细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系,在细胞生长期内(168 h)平均每个细胞耗糖量为3.09×10-8g/24 h,可以根据糖耗量的多少推测细胞生长状态和数量。相同培养液中利用转管微型反应器培养PK-15细胞生产PCV2最终获得的病毒液毒价比转瓶培养毒价提高1.65倍。本实验为PCV2在生物反应器中大规模培养提供了参考依据。     

应用大转瓶结合微载体培养大量生产疫苗的研究

在普通转瓶细胞培养系统中加入微载体进行细胞培养试验。在几种微载体和营养液培养比较试验的基础上,对转瓶单层培养、转瓶载体培养及转瓶单层培养加载体培养三种方法进行了比较。进而应用10000ml大转瓶,用牛胎皮肤继代细胞、IBRS-2细胞,以效果较好的转瓶单层培养加载体培养的方法,进行了病毒疫苗生产试验。经3个毒株、8个大转瓶培养试验,证明培养量可增加1倍,而且TCID_(50)/ml均在8.0以上,方法简便易行,无需特殊的设备与条件。     

犬细小病毒悬浮培养工艺研究

研究旨在证明犬细小病毒(CPV)悬浮培养的可能性,提高CPV P6株抗原的病毒含量,降低转瓶生产不同批次间疫苗质量差异,生产质量稳定的疫苗产品。试验利用大孔的纤维编织物BioNOCⅡ型微载体所提供的巨大表面积,实现Vero细胞高密度培养,建立了Tide-cell生物反应器大规模培养CPV P6株抗原制备工艺。结果显示：生物反应器Tide-cell载体罐内接入1.0×10¹⁰个F81种子细胞,在优化的参数条件下培养,用RPMI 1640培养液经过96 h培养,细胞总数为1.0×10¹¹个;在葡萄糖消耗量约为5 g/(L·h)时,按照病毒感染复数(MOI)=0.02将生产种毒CPV P6株接入Tide-cell微载体细胞培养瓶内,补加含8%血清的RPMI 1640病毒维持液至50 L,调整pH值为7.2～7.3,培养48 h收获,病毒含量至少为10^7.43 TCID50/mL。     

动物细胞规模化培养及生物反应器研究进展

哺乳动物细胞培养已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化生产。许多生物活性物质、疫苗、载体、药用蛋白,等都可以通过动物细胞大规模培养获得。生物反应器是细胞大规模培养的关键,其能够有效的增加细胞单位体积的培养密度,从而为病毒性疫苗大规模生产奠定坚实的基础。通过细胞培养生产生物制品既能提高生物制品的质量,又能促进细胞培养技术、蛋白质表达纯化技术、病     

体外培养方式对猪睾丸细胞代谢的影响

为了解猪睾丸细胞(ST)在体外培养过程中的代谢特点,对方瓶、转瓶和生物反应器培养环境中ST细胞的葡萄糖、乳酸及氨的代谢进行了考察。结果表明3种培养方式的ST细胞生长过程中的葡萄糖消耗、乳酸和氨的生成均主要发生在延滞期和对数生长期这2个阶段,与方瓶和转瓶培养比较,生物反应器系统培养ST细胞的葡萄糖利用率高,乳酸及氨的生成低,优于方瓶和转瓶的培养方式。反应器中前3天的葡萄糖比消耗速率约为5.67mmol(109cell.day)-1,乳酸比生成速率约为2.9mmol(109cell.day)-1,YLac/Gluc约为0.51mmol/mmol,所消耗葡萄糖的26%转化为乳酸。     

ST细胞全悬浮培养的驯化及其培养伪狂犬病毒的工艺研究

将Siat7e基因转染ST细胞,筛选,驯化得到一株可悬浮培养的ST细胞株,此株细胞能够稳定连续传代,适应无血清、高密度培养,最高密度可达6×10⁶/mL,从摇瓶放大至生物反应器,生长稳定;采用驯化的全悬浮ST细胞培养伪狂犬病毒,从接毒时细胞密度、接毒量、收获时间三个方面优化了伪狂犬病毒的培养参数,确定接毒时细胞密度为2.0×10⁶/mL~3.0×10⁶/mL,接毒量为0.1 MOI~1 MOI,收毒时间为接毒后24 h~36 h。经过50 L生物反应器3个批次的工艺验证,培养的病毒含量均不低于109.0TCID50/mL,说明驯化的ST全悬浮细胞适合伪狂犬病毒的培养。     

PK15细胞的无血清全悬浮驯化研究

目前PK15细胞主要用于生产猪圆环病毒2型,传统的培养工艺为滚瓶系统或微载体系统,该两种培养系统都存在各自的劣势。驯化一株全悬浮的PK15细胞可推进工艺的进一步升级,降低成本的同时也简化了培养工艺且更易于产业化。经贴壁降血清培养、低血清悬浮优化传代、无血清悬浮传代培养,对一株贴壁的PK15细胞进行了无血清的全悬浮驯化。传代23次后,该株细胞无血清全悬浮培养初始密度为0. 5×106/m L,在72 h密度可增殖到4. 0×106/m L左右,形态良好,倍增时间稳定,且细胞活率达到95%以上,命名为PK15-S,为大规模培养PK15细胞提供了理论依据。     

犬细小病毒YA-16-C66株纸片载体培养工艺优化及其与转瓶培养工艺的比较分析

采用微型生物反应器确定纸片载体上F81细胞最佳的接种密度和最佳接毒剂量,在NBS反应器中验证温度对犬细小病毒YA-16-C66株增殖的影响。经过三次重复试验,确定利用NBS生物反应器培养犬细小病毒YA-16-C66株最佳工艺为：采用同步接毒法,培养基为含1%新生牛血清的199溶液,细胞接种密度为1.5×10_⁷cells/g,接毒剂量为0.05 MOI,在pH7.2条件下,37.0℃培养48h后降温到35.0℃继续培养24-48小时,细胞病变达到80%~90%时收获上清液。三批次反应器与转瓶工艺产品比较,结果表明：反应器比转瓶收获液病毒含量高1.1~1.9 lg TCID₅₀/100μL;相同培养面积,反应器所得病毒总量是转瓶所得病毒总量的2.8-18.5倍。     

悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析

采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析,比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示,与转瓶培养工艺相比,反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高,生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺,适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。     

激流灌注式生物反应器培养猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)工艺的研究

为建立猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗的大规模生产工艺,本研究应用工作体积为l00 L的激流灌注式生物反应器培养Marc-145细胞,接种PRRS病毒R98株(PRRSV-R98),进行病毒培养,结果显示,培养6d细胞数量可增殖5倍～7倍,单次病毒收获量相当于3 000个～5 000个10L转瓶,而且培养的PRRSV-R98各项指标均符合规程要求.本研究在国内首次建立了应用100 L激流灌注式生物反应器制备PRRS活疫苗的生产工艺,为规模化培养工艺的推广与使用提供了技术参数.     

ST悬浮细胞培养猪伪狂犬病病毒工艺参数的优化

为优化ST悬浮细胞培养条件及其生产猪伪狂犬病病毒的工艺参数,对影响ST悬浮细胞生长的接种细胞初始密度、培养时间和摇瓶转速等工艺参数进行优化比较,对影响猪伪狂犬病病毒增殖的接种细胞初始密度、感染量和培养时间等条件进行优化。结果显示：接种细胞初始密度1.00×106 cells/mL、摇瓶转速140 r/min、悬浮培养48 h时,细胞数量扩增了4倍且细胞活力高;猪伪狂犬病病毒接种时初始细胞密度2.00×106 cells/mL、感染量MOI=1.0、培养60~72 h,毒价可达109.00 TCID50/mL。结果表明,优化后的培养工艺适用于摇瓶中ST悬浮细胞及猪伪狂犬病病毒的培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高猪伪狂犬病病毒繁殖能力提供了试验依据。     

生物反应器培养动物细胞在病毒疫苗生产中的应用

改进病毒规模化生产效率，优化疫苗生产工艺是病毒疫苗研制的关键环节。目前，国内动物细胞制备病毒疫苗的操作方式逐渐从转瓶培养向生物反应器培养转变。生物反应器培养动物细胞的常见方法有悬浮培养、微载体培养、片状载体培养等。生物反应器培养动物细胞有很多优势，可扩大病毒产量，降低成本，易于获取稳定性强、免疫原性高的病毒，有助于机械化控制。生物反应器有潮汐式生物反应器、一次性摇动式生物反应器、一次性填充床生物反应器、微小型生物反应器、新型固定床生物反应器，不同的反应器有不同的特点。对生物反应器培养动物细胞技术在病毒疫苗生产应用领域的研究进行综述，为促进生物反应器的开发与研究提供参考。     

激流式生物反应器制备猪瘟高效细胞苗

在应用激流式生物反应器培养猪瘟病毒(CSFV)试验中,通过提升单位体积的细胞数量可以有效地提升抗原的效价。二种工艺从单位体积细胞数上比较,转瓶培养细胞数可达到2.5×10~5个/mL,反应器是1.5×10~6个/mL,反应器培养的细胞数是转瓶的6倍;从病毒滴度方面相比,转瓶制备的猪瘟抗原效价最高可达到40万RID/mL,反应器可达到60万RID/mL,反应器比转瓶培养的抗原效价提升50%。     

微载体规模化培养PK-15细胞增殖猪圆环病毒2型LG株的研究

正猪圆环病毒2型(Porcine drcovirus type 2,PCV2)可导致动物机体免疫系统功能严重受损,形成免疫抑制,增强对其它多种病原体的易感性,使猪群发生难以控制的复发性疾病和多重感染。目前该病呈全球性流行,给养猪业造成巨大经济损失。疫苗生产时的培养方式依然延用了传统的转瓶培养方式,工序操作繁琐,批间与瓶间细胞生长状态的差异导致PCV病毒滴度的不稳定。生物反应器微载体悬浮培养其营养物质的传递更加