文心兰miR168分子进化特性及其对软腐病侵染的响应模式

【目的】探究文心兰miR168的分子进化特性,揭示文心兰miR168a及其候选靶基因响应软腐病菌侵染的表达模式。【方法】以文心兰miRNA文库、转录组数据库及miRbase数据库获取的植物miR168前体和成熟体序列为研究对象,利用生物信息学方法对其进行系统进化树构建、保守性分析、前体二级结构分析及靶基因预测;通过PCR技术克隆文心兰miR168a前体,采用qRT-PCR技术分析miR168a及其候选靶基因在文心兰不同组织（根、叶、假鳞茎）和感染软腐病（0,12,24,36和48 h）不同时间的表达模式。【结果】植物miR168序列保守性较高,来源于miR168前体的5p臂保守性高于3p臂,miR168前体分歧较大,茎序列的保守性高于环序列;从文心兰中克隆得到93 bp miR168a前体序列,包含21 nt miR168a成熟体序列。进化分析表明,物种亲缘关系对其前体和成熟体序列的形成影响较小;二级结构显示,文心兰miR168a前体能形成典型的发卡结构,其成熟体位于前体的5p臂;随着软腐病侵染时间延长,文心兰miR168a与其候选靶标RNA剪切复合体核心蛋白（AGO1）、RPM1互作蛋白（RIN4）、羧酸酯酶（CXE8）的表达趋势基本呈负相关,而与其候选靶标RNA解旋酶（PRH47A）、泛素羧基末端水解酶（UCH）的表达趋势呈正相关,说明可能存在其他miR168家族成员或miRNAs同时调控。【结论】文心兰miR168与其他植物miR168进化上兼具保守性和特异性,miR168a上调表达可能会增强文心兰的抗病性。     

拟南芥AtBT4对灰葡萄孢的抗性机制分析

【目的】揭示AtBT4在拟南芥抗灰葡萄孢中与SA、JA信号途经的相互关系。【方法】利用RT-PCR技术,检测用SA、SA类似物BTH、JA、ACC及灰葡萄孢处理拟南芥野生型Col-0后其AtBT4的表达情况;检测经SA和JA处理后拟南芥SA、JA途径相关突变体AtBT4的表达情况;并检测接种灰葡萄孢后拟南芥野生型Col-0、bt4突变体和回复突变体抗病相关基因的表达情况。【结果】JA处理和接种灰葡萄孢后,拟南芥野生型Col-0中AtBT4的表达明显增强。但经JA处理后,JA不敏感突变体jar1的AtBT4表达变化趋势与野生型明显不同,AtBT4的表达水平不受JA诱导。SA信号途径相关突变体eds5、sid2和npr1中AtBT4的表达明显低于野生型,但变化趋势与野生型基本一致。bt4突变体中抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达明显低于野生型和回复突变体。【结论】AtBT4的表达受JA和灰葡萄孢的诱导,AtBT4突变影响抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达,AtBT4可能通过SA、JA信号途径影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。     

印度梨形孢最适培养基的筛选及其对水稻的促生作用研究

【目的】内生真菌印度梨形孢Piriformospora indica(Pi)可定殖在多种植物根系中,促进植物生长发育,增强植物抗逆性。【方法】将印度梨形孢接种至8种供试培养基中,测定其在8种培养基中的生长速率,并将印度梨形孢与水稻幼苗共培养,分析印度梨形孢对水稻幼苗株高、叶长、根长、根数、鲜重和叶绿素含量等生物学性状的影响。【结果】8种供试培养基中,V8培养基是最适合印度梨形孢生长的培养基,且加入一定量蔗糖能进一步促进印度梨形孢的生长;研究还发现,接种了印度梨形孢的水稻株高、叶长、根长、根数、叶绿素含量和地上地下部鲜质量都显著高于对照;与对照相比,接种印度梨形孢20 d后的水稻,其株高增高了32.36%,叶绿素含量提高了15.88%。【结论】印度梨形孢是通过增加光合作用和增强根系生理机能,从而促进水稻的生长发育。     

外源茉莉酸甲酯对水稻细菌性条斑病抗性的影响

【目的】研究外源茉莉酸甲酯（MeJA）对水稻细菌性条斑病（简称细条病）抗性的影响，为防治水稻细条病提供理论依据。【方法】以水稻细条病抗性近等基因系 K9、感性近等基因系 G9 为材料，在分蘖期对 K9 和 G9 植株喷施 0.1 mmol/L MeJA，以喷施清水为对照（CK）。分别在 MeJA 处理后 0、12、24、48、72 h接种水稻细条病菌，调查发病情况。进一步研究喷施 MeJA 48 h 后，在 K9 和 G9 植株上接种细条病菌后 0、6、12、24、48 h 激素途径相关基因的表达变化。【结果】K9 植株在喷施 MeJA 后 0、24、48、72 h 接种水稻细条病菌的叶片病斑长度显著短于对照；G9 植株在喷施 MeJA 后 0、12 h 接种水稻细条病菌的叶片病斑长度显著长于对照，而在喷施 MeJA 后 72 h 接种的叶片病斑长度显著短于对照。喷施 MeJA 后 48 h 接种细条病菌，K9 植株中的茉莉酸途径相关基因 LOX2 和 AOS2、病程相关基因 PR10 的相对表达量较对照上调，水杨酸途径相关基因 PAD4和 PAL、乙烯途径相关基因 EIN2 和 ERF70、病程相关基因 PR1a 的相对表达量较对照下调；G9 植株中的茉莉酸途径相关基因 LOX2 和 AOS2、水杨酸途径相关基因 PAD4 和 PAL、病程相关基因 PR1a 和 PR10 的相对表达量较对照上调，乙烯途径相关基因 EIN2 的相对表达量较对照下调。【结论】外源茉莉酸甲酯影响抗、感性近等基因系对细条病的抗性，随 MeJA 处理后接种时间点的不同，抗、感近等基因系对细条病菌的抗性反应不同。外源茉莉酸甲酯通过诱导茉莉酸、水杨酸和乙烯途径相关基因和病程相关基因的表达，参与对细条病侵染的防御反应。     

甜叶菊褐斑病的病原菌鉴定及MeJA的抗病作用

【目的】明确引起甜叶菊褐斑病的病原菌种类,分析MeJA在甜叶菊响应链格孢菌过程中的作用,为甜叶菊褐斑病的防治及抗病育种提供依据。【方法】对取自江苏省东台市富安镇甜叶菊生产基地的发病甜叶菊植株的叶片进行病原菌分离、纯化培养,观察菌落及分生孢子的形态、大小和病原菌的致病性。采用离体叶片接种的方法进行致病性测定。利用真菌通用引物ITS1和ITS4对7个致病菌株ST1-ST7的r DNA-ITS区进行扩增,对扩增产物进行回收和测序,并利用MEGA 7软件的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建基于病原菌的r DNA-ITS序列和Gen Bank中相关链格孢菌序列的系统发育树,确定病原菌的种类。利用台盼蓝染色、光学显微镜观察分析链格孢菌分生孢子在甜叶菊叶片上的萌发状态及侵入叶片的方式。通过向马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)上外源添加MeJA分析其对链格孢菌菌丝生长的影响;对甜叶菊离体叶片饲喂MeJA并接种链格孢菌,观察叶片对链格孢菌的抗性;采用q PCR方法分析JA通路相关基因在甜叶菊叶片接种链格孢菌前后的表达情况。【结果】从甜叶菊发病叶片上共分离到7个菌株,所有菌株在PDA培养基上呈近圆形等径辐射生长,气生菌丝较为发达,初期为白色,后期逐渐变为不同程度的灰黑色,分生孢子单生或成链,多为近球形、倒棒状或倒梨形,大小为(20.5—45.5)×(6.5—16.0)μm。将所分离得到的菌株接种于甜叶菊离体叶片上,发现7个菌株对甜叶菊叶片致病程度存在一定差异,ST2、ST3和ST7 3个菌株侵染叶片后病斑扩展速度快,致病力较强。3个致病力较强的菌株的r DNA-ITS序列长度分别为569、570和570 bp,通过系统进化树分析,ST2、ST3与菌株KY814634.1、DQ491089.1等(Alternaria alternata、Alternaria sp.,链格孢)的相似度达到99%—100%,ST7与菌株HQ402558.1(Alternaria tenuissima,细极链格孢)的相似度达到99%。对接种细极链格孢ST7分生孢子的甜叶菊叶片台盼蓝染色后的观察结果发现,分生孢子可以从孢子的头部、侧面、尾部多个位置萌发,从叶片的气孔和表皮细胞间隙侵入叶片表皮细胞内。外源施加浓度高于200μmol·L~(-1)的MeJA能有效抑制细极链格孢菌丝的生长;甜叶菊离体叶片饲喂100μmol·L~(-1)的MeJA后接种细极链格孢,病斑面积明显小于对照,表明MeJA可增强甜叶菊对细极链格孢的抗性;JA通路相关基因LOX3和JAR1在甜叶菊接种细极链格孢后上调表达,JAZ1和JAZ4反之下调表达,表明JA通路参与甜叶菊对细极链格孢的响应。【结论】江苏省东台市富安镇甜叶菊生产基地甜叶菊褐斑病的致病菌为链格孢菌。细极链格孢菌丝可以从叶片的气孔以及表皮细胞间隙侵入表皮细胞。外源施加MeJA能够有效增强甜叶菊叶片对细极链格孢的抗性,在甜叶菊褐斑病的防治中具有很好的应用前景。     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

印度梨形孢对植物生长调节剂在水稻上过量使用的缓解作用

【目的】植物生长调节剂过量使用会对植物的生长造成不利影响,严重情况下甚至抑制植物生长,而印度梨形孢(Piriformospora indica,简称Pi)是一种植物根部内生菌,能增强植物的抗逆能力,探究印度梨形孢对植物生长调节剂在水稻上过量使用的危害是否具有缓解作用可为缓解植物生长调节剂胁迫提供方法依据。【方法】利用国际水稻营养液培养水稻,施加过量植物生长调节剂(2,4-D或PP333),水培15 d后,分别测量各组水稻株高、根长、根数、根系活力及叶绿素含量,观察叶片ROS染色情况,分析在印度梨形孢是否接种的情况下,2,4-D或PP333对水稻叶片中抗氧化酶(SOD、POD、CAT)的活性变化影响。【结果】施加过量植物生长调节剂,水稻生长状况受到抑制,接种过印度梨形孢的水稻受影响较未接种小;+Pi、+2,4-D组与-Pi、+2,4-D组相比,株高增加26.02%,根长增加17.27%,根数增加30.77%,叶绿素含量增加64.71%,根系活力增加43.72%;+Pi、+PP333组与-Pi、+PP333组相比,株高增加36.79%,根系活力增加23.64%;接种印度梨形孢以及2,4-D或PP333处理,使水稻叶片中ROS含量增加;2,4-D或PP333处理使水稻SOD、POD、CAT活性升高,接种过印度梨形孢的水稻,抗氧化酶活性维持在正常水平。【结论】印度梨形孢对植物生长调节剂在水稻上过量使用具有缓解作用。植物生长调节剂过量使用的情况下,接种印度梨形孢的水稻株高增高、根系发达,植株整体发育比未接种印度梨形孢的水稻良好,印度梨形孢可能通过恢复水稻活性氧系统平衡,一定程度上减少水稻受植物生长调节剂过量使用的抑制作用。     

毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因PtHDT902在叶枯病应答反应中的功能

研究了毛果杨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)基因PtHDT902在水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和链格孢菌(Alternaria alternata,A.alternata)侵染条件下的表达,以及对链格孢菌引起的叶枯病的抗性功能的探究。研究结果表明：链格孢菌、SA和MeJA处理能够诱导毛果杨叶片中PtHDT902的表达。野生型84K杨(WT)和PtHDT902转基因植株叶片接种链格孢菌7 d后,与野生型相比,转基因植株的叶片感病程度较严重,表明PtHDT902基因在84K杨中的过量表达降低了植株对链格孢菌的抗性;抗病相关基因PR1-1、PR4以及JA合成相关基因LOX在转基因植株叶片中的表达量明显低于野生型的叶片,而JA合成途径的抑制因子JAZ10在转基因植株叶片中的表达量高于野生型。研究结果证明,PtHDT902在杨树响应链格孢菌侵染的过程中具有重要的作用。     

小麦蒜氨酸酶基因TaAly1的克隆及表达特征分析

【目的】克隆小麦蒜氨酸酶基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时定量表达检测。【方法】采用电子延伸结合RT-PCR方法,从小麦叶片分离出蒜氨酸酶基因,网络资源分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在不同条件下的表达情况。【结果】克隆到1个小麦蒜氨酸酶基因TaAly1,其开放阅读框全长1 023 bp,编码340个氨基酸,与水稻和玉米蒜氨酸酶基因的同源性为70%,其基因组DNA序列含有3个内含子;TaAly1在小麦幼苗根部几乎不表达,在叶部表达量最高,其次是茎部;植物激素GA、MeJA、SA处理及条锈菌接种和干旱、低温处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。【结论】成功克隆了小麦TaAly1基因的CDs区,该基因可能通过依赖GA、MeJA和SA的信号通路参与小麦与条锈病的互作。     

棉花GhPBL1基因克隆及抗枯萎病功能研究

【目的】克隆棉花中类受体胞质激酶（RLCK）基因GhPBL1,并进行抗枯萎病功能研究,为棉花抗病分子育种提供新的基因资源。【方法】基于枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱数据,并结合棉花数据库,从中筛选并克隆棉花RLCK家族基因GhPBL1,利用生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量技术（qRT-PCR）检测基因在不同抗性品种的不同组织及枯萎病菌和外源激素处理下的表达情况,并通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术研究GhPBL1基因的抗枯萎病功能。【结果】GhPBL1基因的开放阅读框（ORF）为1116 bp,编码371个氨基酸残基,含有STYKc保守结构域,位于第81~360位氨基酸,属于RLCK家族基因。GhPBL1基因在抗病材料和感病材料的根、茎和叶中均有表达,且均在根中的相对表达量最高。枯萎病菌处理后,抗病材料中GhPBL1基因的表达水平明显高于感病材料。水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）均能诱导GhPBL1基因的表达,但该基因对SA胁迫响应时间早于MeJA胁迫。与对照植株（TRV:00）相比,TRV:GhPBL1沉默植株更易感病,且其抗病相关基因GhEDS1、GhCCR1、GhHCT1和Gh4CL的相对表达量显著（P<0.05）较低,但GhPR5基因的相对表达量极显著（P<0.01）较高。【结论】 GhPBL1基因具有明显的组织表达特异性,在抗病材料和感病材料中的表达水平存在差异,能被枯萎病菌诱导表达上调,且能响应SA和MeJA胁迫,推测GhPBL1基因在棉花抗枯萎病和外源激素胁迫中发挥正调控作用。     

茉莉酸甲酯对猕猴桃果实抗葡萄座腔菌过程中能量代谢和膜脂代谢的影响

【背景】由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的软腐病是猕猴桃果实贮藏期的重要病害,对猕猴桃产业造成了严重的经济损失。茉莉酸甲酯(MeJA)是一类广泛存在于植物体内的生物信号分子,前期研究发现MeJA能够有效诱导猕猴桃果实抵御B.dothidea的侵染。【目的】分析MeJA对果实能量代谢和膜脂代谢的影响,深入解析MeJA介导的猕猴桃果实抗病机理。【方法】以‘红阳’猕猴桃(Actinidia chinensis cv.Hongyang)为试验材料,分3组进行试验：接种组(Inoculation),果实不经过MeJA处理,但接种B.dothidea;MeJA+接种组(MeJA+inoculation),果实经过0.1 mmol·L^-1MeJA熏蒸处理24 h并接种B.dothidea;对照组(Control),不作任何处理,即未经MeJA处理且不接种B.dothidea。所有果实于培养箱((20±1)℃、相对湿度90%—95%)中贮藏8 d。利用2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(H₂DCFDA)染色分析果实活性氧(ROS...     

不同磷水平下印度梨形孢对生菜生长及磷素吸收利用的影响

通过盆栽砂培法研究了印度梨形孢(Piriformospora indica)真菌在生菜(Lactuca sativa var.crispa)根系的定殖情况及在4种磷水平(常规磷、50%常规磷、25%常规磷、不施磷)下接种印度梨形孢对生菜生长及磷素吸收的影响。结果表明:印度梨形孢能在生菜根系有效定殖,定殖率为72%。常规磷、50%常规磷、25%常规磷水平下,接种印度梨形孢的生菜叶绿素含量(SPAD值)比不接种处理分别显著增加了23.6%、13.5%、11.3%。同时,接种处理显著增加了生菜地上部和地下部的生物量,其中50%常规磷+接种处理与常规磷+不接菌处理的地上部鲜质量相当。生菜全磷含量检测结果表明,4种不同供磷水平下,接种印度梨形孢的生菜植株全磷含量分别是不接菌处理的1.25、1.18、1.48、1.71倍。综上,印度梨形孢真菌能提高生菜对磷素的吸收,促进生菜生长。     

三环唑诱导水稻抗性相关基因的表达分析

【目的】探讨三环唑处理下水稻抗性相关基因表达的动态变化及与抗瘟性的相关性。【方法】室内抑菌活性测定三环唑对稻瘟病菌丝生长和孢子萌发的抑制作用;温室不同时间点接种稻瘟病菌后施用三环唑,测定其防效;利用实时荧光定量PCR对水稻受三环唑处理后不同时间点诱导抗性相关基因进行表达分析。【结果】三环唑对水稻稻瘟菌菌丝生长和孢子萌发无显著抑制作用;接种稻瘟病菌24 h后施用三环唑,仍然能够获得87.2%的防治效果。RT-q PCR结果表明,三环唑能够诱导水稻防卫反应基因Os NH1-1、Os PR1a和Os PR10的表达,进一步选取水杨酸和茉莉酸途径的关键基因进行检测,发现茉莉酸途径的关键基因Os LOX和Os AOS2的表达受到三环唑显著诱导。【结论】三环唑防治稻瘟病并非仅仅抑制了黑色素的合成,三环唑对水稻具有诱导抗性作用,三环唑主要通过茉莉酸途径起诱导抗性作用。     

家蚕感染球孢白僵菌后4种抗菌肽基因的表达分析

【目的】阐明家蚕(Bombyxmori)抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式,为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况,比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后,cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍,在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍,在马氏管中感染初期显著上调表达(P<0.05,下同),在中肠中感染后期显著上调表达;gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程,最高上调表达倍数为15.7倍,在血淋巴中感染前期呈上调表达,在马氏管中略呈下调表达,中肠中的gloverin2基因在接种后16~48 h呈显著上调表达,最高上调表达倍数为6.7倍;lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍,在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达,在中肠中则是接种后24~48 h呈显著上调表达;lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达,在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达,但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达,尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显,由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。     

内生真菌印度梨形孢对水稻苗期耐盐性的影响

[目的]研究印度梨形孢(Piriformospora indica)对盐(NaCl)胁迫后水稻幼苗生长发育的影响,明确印度梨形孢提高水稻幼苗耐盐性的机理.[方法]采用不同浓度(0、50、100、150和200 mmol/L)的盐(NaCl)溶液处理水稻幼苗,72 h后加入5×105个/mL的印度梨形孢孢子悬浮液10 mL侵染水稻根部(接种处理),以未侵染为对照(不接种,CK);20 d后测定水稻幼苗叶片的丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性等生理指标,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测耐盐相关基因的表达情况.[结果]盐胁迫处理后,与CK相比,接种处理水稻幼苗的MDA含量降低,叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性升高.其中,盐胁迫浓度为150和200 mmol/L时,CK的MDA含量是接种处理的1.5和2.8倍;盐胁迫浓度为150 mmol/L时,接种处理的Pro含量是CK的2.1倍;盐胁迫浓度为200 mmol/L时,接种处理的可溶性糖含量是CK的1.8倍;差异均达显著水平(P<0.05,下同).qPCR检测结果表明,经盐胁迫后接种处理水稻幼苗叶片中耐盐相关基因SNAC1、OsNAC6、OsBZIP23和OsDREB2A的表达量均高于CK,各基因表达量均在100 mmol/L处理下达最大值,其中SNAC1和OsNAC6基因表达量分别是CK的1.5和1.1倍,差异达显著水平.[结论]接种印度梨形孢可降低盐胁迫后水稻幼苗叶片的MDA含量,提高抗氧化酶活性及Pro、叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量,同时促使水稻叶片中耐盐胁迫相关基因的表达量上调,从而增强水稻幼苗对盐胁迫的耐受性.印度梨形孢作为生物菌肥在农业生产中有潜在的利用价值.     

甘蓝型油菜LOX2基因在MeJA、BTH和核盘菌诱导下的表达

利用荧光定量PCR技术,检测了甘蓝型油菜脂氧合酶基因LOX2在化学激素(MeJA和BTH)处理和核盘菌(Sclertinia sclerotiorum)接种后的表达差异,以及核盘菌诱导处理后LOX2基因在不同油菜菌核病抗性品种中的表达差异.结果显示:MeJA处理后,LOX2基因的表达水平在24 h达到最高,是处理前的30.3倍,表明LOX2基因的表达受MeJA诱导;相反,LOX2基因的表达受水杨酸类似物BTH的明显抑制.进一步研究表明:LOX2基因在核盘菌接种后期明显诱导上调表达,接种72 h后在高抗品种D083、中高抗品种ZS9和高感品种84039的表达量分别为接种前的5.0倍、2.7倍和1.7倍.因此,初步推测LOX2基因的高表达在油菜对菌核病抗性中起重要作用,参与了茉莉酸介导的菌核病抗性防御反应.     

亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制

【背景】灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是危害番茄（Solanum lycopersicum）的重要病害之一,防治不及时可造成30%—40%减产。目前生产上多以化学防治为主,但存在农产品安全及环境污染的风险。N-酰基乙醇胺（NAE）是植物体内天然存在的一类脂质生物活性化合物,其在哺乳动物中具有多种免疫功能,但其在植物免疫中的作用和机制尚不清楚。【目的】探讨N-酰基乙醇胺在诱导番茄对灰葡萄孢防御中的作用,为研发番茄灰霉病绿色防控技术提供依据。【方法】将灰葡萄孢分别接种在含有硬脂酰乙醇胺（NAE 18:0）、亚油酸乙醇胺（NAE 18:2）、廿二碳五烯酸乙醇胺（NAE 22:5）的培养基上,观察灰葡萄孢的生长情况。在此基础上,以番茄‘Moneymaker’植株为材料,硬脂酰乙醇胺、亚油酸乙醇胺、廿二碳五烯酸乙醇胺外源处理番茄叶片后接种灰葡萄孢,统计病情指数,测定荧光参数。采用qRT-PCR技术明确亚油酸乙酰胺处理后番茄叶片灰葡萄孢Actin的相对表达量,进一步测定番茄叶片中主要抗病基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1、PYR1a等的相对表达量及茉莉酸（jasmonic acid,JA）、水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（ethylene,ETH）、脱落酸（abscisic acid,ABA）、生长素（indoleacetic acid,IAA）含量。并以乙烯信号转导突变体植株never ripe（nr）及对照植株Pearson（PB）为材料,在外源亚油酸乙酰胺处理后接种灰葡萄孢,测定番茄叶片叶绿素荧光参数和灰葡萄孢Actin的相对表达量。【结果】体外培养试验结果表明灰葡萄孢生长并不受外源N-酰基乙醇胺的影响,外源施用N-酰基乙醇胺能显著提高番茄植株对灰霉病的抗性,缓解由灰葡萄孢侵染导致的番茄叶片光系统II实际光化学效率（Φ_PSII）的下降。3种N-酰基乙醇胺中,亚油酸乙醇胺施用后番茄叶片灰霉病病情指数下降最为明显,灰葡萄孢Actin的相对表达量下调60%,其诱导灰霉病抗性效果最佳。番茄植株接种灰葡萄孢后抗性基因PI I、PR-1、NPR1、Nr、ACO1的表达水平均有不同程度上调。外源亚油酸乙醇胺处理使得番茄响应灰葡萄孢接种后PI I、Nr、ACO1的表达进一步增强,其中乙烯合成基因ACO1的表达水平最高。番茄植株接种灰葡萄孢后叶片水杨酸、茉莉酸、生长素和乙烯含量增加,但外源亚油酸乙醇胺处理并接种灰葡萄孢后只有乙烯含量显著增加。进一步研究发现,番茄乙烯突变体nr植株中,外源亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性诱导作用显著受到抑制。【结论】外源施用亚油酸乙醇胺能够提高番茄内源光合效率和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量,增强番茄植株对灰霉病的抗性,推测其诱导抗性作用可能与乙烯信号路径相关。     

番木瓜WRKY转录因子CpWRKY11的克隆和表达

【目的】克隆番木瓜炭疽菌诱导的WRKY转录因子CpWRKY11,研究其在生物胁迫、外源激素处理及非生物胁迫条件下的表达特征,为CpWRKY11基因在后续番木瓜分子育种中的应用提供理论支持。【方法】从自主选育的炭疽病抗性品种中克隆WRKY转录因子CpWRKY11,采用SMART、ExPaSy、NetPhos 和DNAMAN软件对该基因及其编码的蛋白序列进行生物信息学分析,利用MEGA-X软件进行系统进化树构建和分析;构建亚细胞定位载体CpWRKY11-GFP,通过转化水稻原生质体,确定CpWRKY11的亚细胞定位情况;利用酵母单杂交试验验证CpWRKY11是否具有转录激活活性;采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析CpWRKY11在番木瓜不同组织 (根、茎、叶、花和果实)及生物胁迫(短孢炭疽菌和番木瓜畸形花叶病毒侵染)、外源激素 (水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利（ETH）)和非生物胁迫 (高盐、干旱和机械损伤) 处理下的表达情况。【结果】CpWRKY11基因编码序列全长1 719 bp,编码572个氨基酸;CpWRKY11含有60个磷酸化位点,理论分子量为62.31 ku,理论等电点为6.75,不稳定指数为 51.17,亲水性为-0.792,是一个亲水不稳定蛋白。CpWRKY11有2个典型的WRKY结构域,同源氨基酸比对及进化树分析结果显示,CpWRKY11与拟南芥AtWRKY20的同源性最高,属于WRKY家族Ⅰ类。亚细胞定位结果显示,CpWRKY11只定位在细胞核上。酵母转录激活验证试验结果显示,CpWRKY11蛋白不具有转录激活活性。CpWRKY11在番木瓜中为组成型表达,在茎中表达量最高,其次为根、果实和花,在叶中的表达量最低。CpWRKY11受短孢炭疽菌和PLDMV的诱导上调表达,在短孢炭疽菌诱导48 h 内持续上调,与 0 h对照相比其表达量均显著上调,且在反应后期(24和48 h)表达量更高。在PLDMV处理条件下,除接种第3天外,CpWRKY11也均呈现出明显的上调趋势。外源激素处理结果显示,CpWRKY11受SA、ETH和MeJA的诱导上调表达,尤其是在MeJA处理下,CpWRKY11被强烈诱导而显著上调表达,处理48 h内的表达量较对照上调1.9倍以上。CpWRKY11受机械损伤的强烈诱导,表达量显著上调。【结论】CpWRKY11是调控番木瓜逆境胁迫响应,尤其是病原菌侵染及机械损伤响应的重要因子。CpWRKY11可能主要通过JA信号途径参与病原菌应答反应,是具有潜在利用价值的重要候选基因。     

病原诱导的小麦转录因子TaERF1b基因的分离和表达

 【目的】研究一个病原诱导的小麦ERF转录因子基因在对纹枯病菌、赤霉病菌防御反应中的作用。【方法】应用生物信息学、RT-PCR、RACE方法,从赤霉病菌诱导的小麦中,分离ERF转录因子基因的全长cDNA序列;利用半定量RT-PCR方法,分析该基因对小麦纹枯病菌、赤霉病菌及MeJA、ET和SA处理的应答表达情况。【结果】从赤霉病菌诱导的抗赤霉病小麦品种苏麦3号cDNA中,分离出1个编码ERF转录因子基因的全长cDNA序列。该基因暂被命名为TaERF1b,编码由280个氨基酸组成的蛋白质TaERF1b。TaERF1b具有保守的ERF/AP2结构域,但TaERF1b蛋白全长氨基酸序列与已克隆的ERF蛋白同源性较低（＜36.5%）。TaERF1b基因表达分析的结果表明,纹枯病菌、赤霉病菌侵染可快速诱导抗病小麦中TaERF1b基因的上调表达,该基因转录表达水平在防卫相关激素乙烯、茉莉酸处理早期显著增强,而且TaERF1b对外源乙烯、茉莉酸处理的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌的响应时期。【结论】分离出一个受病原诱导的小麦ERF新基因TaERF1b,其编码蛋白TaERF1b为植物ERF转录因子家族的一个新成员,可能通过茉莉酸、乙烯信号途径介导小麦对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

红橘响应褐斑病菌侵染的转录组学分析

【目的】 明确红橘（Citrus reticulata Blanco, cv. Hongjv）接种褐斑病致病菌——链格孢菌橘致病型（Alternaria alternata tangerine pathotype）后基因种类和表达量在转录水平的变化规律,确定红橘响应该致病型侵染的关键基因。【方法】 采用链格孢菌橘致病型接种红橘离体叶片,28 h后选取感病叶片和未接种叶片提取RNA,进行转录组高通量测序,然后利用生物信息学分析,以甜橙基因组为参考,以|log₂ fold change|≥1,q-value≤0.01为阈值选取感病和健康红橘叶片转录组的差异表达基因,应用GO数据库对差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）进行功能分类,KEGG分析代谢途径,MapMan软件分析生物胁迫信号通路相关基因的表达变化。采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。【结果】 红橘接种链格孢菌橘致病型28 h后产生大量与胁迫相关的差异表达基因,获得上调差异基因5 173个,下调差异基因6 555个。GO功能分类显示差异基因主要与蛋白结合、膜、氧化还原过程等相关。通过KEGG富集和MapMan软件分析发现,红橘在受链格孢菌橘致病型胁迫的过程中基础代谢被严重破坏。乙烯、水杨酸和生长素等寄主防御相关的植物激素信号转导途径多个基因表达出现差异,其中乙烯起主导作用,乙烯受体ETR 3个成员被不同程度激活,下游激酶和乙烯响应因子均上调,生长素大部分关键信号基因、绝大部分生长素响应因子ARF和水杨酸合成途径的基因均下调表达。同时,黄酮醇、花青素、萜类化合物和生物碱合成相关基因受该菌诱导显著变化,萜类合成中大部分基因下调,而黄酮类合成相关上调基因数量和表达趋势均强于表达下调基因,有抗虫和抑菌作用的硫代葡萄糖苷基因呈上调趋势。进一步研究发现,大量参与抗逆过程的转录因子如WRKY、bZIP、ERF、MYB、NAC被诱导激活,其中大部分WRKY和bZIP转录因子受该菌正向调控,超过50%的ERF家族基因表达上调;在转录因子调控下,PTI及ETI响应基因如受体激酶、R蛋白、NBS抗病蛋白等大量表达,多个PR家族抗菌蛋白基因上调表达,22个抗氧化保护酶系统POD成员基因受到活性氧信号激发大量表达。以上结果表明链格孢菌橘致病型侵染对寄主内部生理状态产生显著影响。选取了19个与植物抗病相关基因进行qRT-PCR分析,其基因表达趋势与测序数据一致。【结论】 获得了红橘响应链格孢菌橘致病型侵染的差异表达基因及显著上调表达基因,其主要富集于代谢过程、应激反应及转录调控等条目中,这些基因的相互协同调控是红橘对该致病型产生防御反应的重要机制。