基于高通量测序组装‘赤霞珠’叶绿体基因组及其特征分析

【目的】以欧亚种葡萄‘赤霞珠’(Cabernet Sauvignon)为试材,建立适于葡萄属(Vitis)植物完整叶绿体基因组组装及其特征分析的方法,为研究葡萄属植物的进化和系统发育提供方法指导。【方法】采用Illumina Hi Seq PE150双末端测序策略对其全基因组DNA建库测序,建库类型为350 bp DNA小片段文库,测序深度为10倍。以已发表的拟南芥(Arabidopsis thaliana)和欧亚种葡萄‘黑比诺’(Pinot Noir)的叶绿体基因组序列为参考,通过BLASTN比对提取葡萄叶绿体基因组序列,并用SOAPdenovo软件进行组装,得到‘赤霞珠’完整的叶绿体基因组并对其进行特征分析。【结果】基于高通量Illumina测序,共获得5.2 G的全基因组原始数据,其中,葡萄叶绿体基因组序列为0.42 G,约占全基因组序列的8%。用抽提出来的葡萄叶绿体基因组序列成功组装出‘赤霞珠’完整叶绿体基因组。特征分析表明,叶绿体基因组序列全长160 676 bp,包括大单拷贝区(large single copy,LSC)、小单拷贝区(small single copy,SSC)和2个反向重复序列(inverted repeat,IRA和IRB),长度分别为89 134、19 072和26 235 bp,具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构;共注释得到154个基因,包括99个蛋白编码基因、47个t RNA基因和8个r RNA基因;其叶绿体基因组的GC含量为37.43%;共检测到37个串联重复序列(tandem repeat sequence)和53个散在重复序列(dispersed repeats),其中,绝大部分串联重复序列的长度为11—42 bp,占叶绿体基因组序列的0.83%,而散在重复序列占叶绿体基因组序列的5.33%;此外,还检测到50个简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)位点,大部分的SSRs均由A或T组成,同时SSRs在‘赤霞珠’叶绿体基因组上的分布是不均匀的,LSC区段含有39个SSRs,而SSC区段和IR区段分别仅有7个和4个SSRs;与蛋白编码基因对应的密码子偏好使用A/T碱基,并且编码亮氨酸(L)的密码子使用频率最高,而编码半胱氨酸(C)的密码子使用频率最低;系统发育分析表明‘赤霞珠’与‘黑比诺’、夏葡萄(Vitis aestivalis)、圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)亲缘关系最近。【结论】基于全基因组高通量测序的方法,成功组装出‘赤霞珠’完整的叶绿体基因组,与传统获得叶绿体基因组的方法相比,此方法不需要分离叶绿体和提取cpDNA,缩短了试验时间、降低了劳动强度,并且极大地提高了试验的可行性。‘赤霞珠’叶绿体基因组的基因结构、基因顺序、GC含量和密码子偏好性均与典型的被子植物叶绿体基因组类似。     

基于Illumina高通量测序技术分析草莓表面微生物结构

为了解不同基地草莓表面微生物的结构特点,在浙江省8个草莓生产基地采集草莓样本,并提取表面微生物DNA样本,利用特异性的引物分别对细菌16S rRNA基因的V3~V4区进行PCR扩增,然后基于Illumina高通量测序技术分析不同基地草莓微生物的菌群结构。结果表明,不同基地草莓表面微生物在门的水平上主要包括变形菌门、厚壁菌门、蓝藻细菌门、放线菌门、拟杆菌门;在属的水平上,优势菌属主要为布赫纳氏菌属、甲基杆菌属和葡糖杆菌属,其中所检出的寡养单胞菌属、苯基杆菌属、埃希杆菌属和葡萄球菌属均具有一定的致病性。由此说明高通量测序技术应用于草莓表面微生物的分析,可在一定程度上提供草莓污染的病原菌信息。     

濒危鱼类暗色唇鲮的肌肉营养品质评价

采用最新国家标准规定的方法测定了野生暗色唇鲮(Semilabeo obscurus)肌肉的一般营养成分、氨基酸和脂肪酸含量,并评价了其肌肉营养品质。结果显示:暗色唇鲮的肌肉中水分、蛋白质、脂肪和灰分的平均含量分别为77.95%、19.40%、0.895%和1.49%;从暗色唇鲮的肌肉中共检出17种氨基酸,氨基酸总量为81.71%,其中必需氨基酸7种(总含量28.87%),半必需氨基酸2种(总含量6.44%),非必需氨基酸8种(总含量46.40%),鲜味氨基酸6种(总含量34. 91%),支链氨基酸3种(总含量12. 67%),芳香族氨基酸2种(总含量5.46%);其必需氨基酸含量组成基本符合FAO/WTO的理想蛋白质推荐值。依据氨基酸评分和化学评分结果,暗色唇鲮肌肉的第一限制氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸,第二限制氨基酸为缬氨酸。其必需氨基酸指数为73.71。     

濒危鱼类暗色唇鲮的肌肉营养品质评价

采用最新国家标准规定的方法测定了野生暗色唇鲮(Semilabeo obscurus)肌肉的一般营养成分、氨基酸和脂肪酸含量,并评价了其肌肉营养品质。结果显示:暗色唇鲮的肌肉中水分、蛋白质、脂肪和灰分的平均含量分别为77.95%、19.40%、0.895%和1.49%;从暗色唇鲮的肌肉中共检出17种氨基酸,氨基酸总量为81.71%,其中必需氨基酸7种(总含量28.87%),半必需氨基酸2种(总含量6.44%),非必需氨基酸8种(总含量46.40%),鲜味氨基酸6种(总含量34. 91%),支链氨基酸3种(总含量12. 67%),芳香族氨基酸2种(总含量5.46%);其必需氨基酸含量组成基本符合FAO/WTO的理想蛋白质推荐值。依据氨基酸评分和化学评分结果,暗色唇鲮肌肉的第一限制氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸,第二限制氨基酸为缬氨酸。其必需氨基酸指数为73.71。     

基于Illumina高通量测序的岩原鲤转录组分析

为获得岩原鲤转录组信息,发掘功能基因,本研究采用Illumina高通量测序技术对岩原鲤全组织转录组进行测序。结果获得64 257 918个EST序列,经拼接和组装得到83 252条单基因序列(unigene),平均长度787 bp,长度范围201~16 572 bp。利用NCBI的蛋白质非冗余数据库(Nr)对所有unigene进行相似性搜索,共有37 157条unigene(44.63%)与数据库中的已知序列同源。利用Blast2GO v2.5软件对unigene进行注释,共得到29 919条(35.93%)注释基因,根据GO功能分类将其分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类56亚类。经KOG注释及分类,共有17 869条(21.49%)unigene成功注释到真核直系同源组中,并将其分为26个功能组分。经KEGG代谢通路分析可分为5大类(细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢和有机系统)32小类共267个代谢通路。本研究通过高通量测序技术,对岩原鲤转录组进行测序,获得了大量的转录组信息,为岩原鲤功能基因克隆及基因组学研究提供了基础。     

基于高通量测序的福安刺葡萄基因组初步研究

为进一步了解福建福安刺葡萄的遗传背景,寻找刺葡萄与欧亚种葡萄之间的遗传差异,本研究基于高通量测序技术展开对福安刺葡萄基因组的分析,共得到测序数据8.4Gb,鉴定出3 192 484处非冗余遗传差异。差异位点分布位置结果显示,30.34%的差异位于基因间区,3.67%的差异位于基因外显子区。通过对比葡萄参考基因组序列,共鉴定出刺葡萄基因组上存在1 863 237个同源SNP、1 244 590个异源SNP位点,表明本次测序所用的福安刺葡萄有可能是异源二倍体。     

应用Illumina高通量测序技术分析中华真地鳖肠道微生物多样性

为了调查中华真地鳖肠道微生物多样性,应用Illumina高通量测序技术测定3个中华真地鳖肠道样本中微生物的16S r DNA-V4变异区序列,采用UPARSE等软件分析和统计样品中的操作分类单元(OTU)数量,并进行聚类分析,计算肠道微生物物种丰度。物种多样性分析显示,OTU数量为1 602~1 852个。3个样本中共检测到31个菌门,其中优势菌门是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门;共检测到309个菌属,优势菌属是Parabacteroides、Alistipes、沙雷氏菌属、Christensenellaceae R-7 group、乳酸杆菌属、Candidatus Symbiothrix、Clostridium sensu stricto 1。     

基于Illumina平台转录组测序筛选牛卵泡发育调控基因

运用超声波监测技术,采集母牛发情期出现偏差前的第一大卵泡PDF1和出现偏差后的第二大卵泡ODF2,分别分离卵泡颗粒细胞(GCs),构建RNA文库,用Illumina2000测序;测序结果经数据库搜索和差异表达筛选,采用DAVID软件GO和KEGG pathway分析,经Genecards功能查询,筛选牛卵泡发育相关基因。结果表明:数据库搜索共获得35 325个基因,其中有意义的表达基因15 645个,从中筛选获得差异表达基因608个;GO分析表明,608个差异表达基因中参与生物过程的基因占60.46%,细胞组分的基因占20.08%,分子功能的基因占11.46%;KEGG pathway分析表明,608个差异表达基因通过9条信号通路参与牛卵泡发育调控(P0.05),经Genecards功能筛选,共获得11个与牛卵泡发育密切相关的调控基因——SESN3、COL3A1、CCNE1、CAV1、CACNA1H、ITPR1、PIK3R3、MYC、PTGFR、CDK6、GAPDH,它们直接参与细胞增殖分化及信号通路调节。     

利用Illumina MiSeq测序平台分析肉鸡盲肠微生物多样性

为对肉鸡盲肠微生物的多样性进行探索,选取15只饲养在相同条件下的科宝-500肉鸡,利用Illumina MiSeq测序平台与Qiime等16srRNA序列分析工具在22日龄时采集盲肠内容物进行研究。结果显示:1)测序共获得359 158条有效序列与3 210个OTU,并且由稀释曲线可以证明此次测序结果比较全面的覆盖了肉鸡盲肠微生物群落。2)各样品菌群之间存在差异,得到序列的数量以及菌群多样性差别较大。3)通过核心菌群分析可知,4个共享菌群在门水平上分别为:拟杆菌门Bacteroidetes(70.0%±12.1%)、厚壁菌门Firmicutes(25.4%±11.2%)、变形菌门Proteobacteria(4.3%±3.7%)和蓝菌门Cyanobacteria(0.3%±0.5%)。4)有益菌群如乳酸杆菌属Lactobacillus、双歧杆菌属Bifidobacterium虽然存在于盲肠微生物中,但相对丰度不高。5)PICRUSt分析盲肠菌群对应的基因功能发现:功能转运、嘌呤代谢、DNA修复重组蛋白、氧化磷酸化和甲烷代谢等基因功能丰度最高。由此可见,个体差异虽然对肉鸡盲肠微生物结构影响较大,但是仍然存在不少共性。     

唇鲮染色体核型的研究

采用PHA和秋水仙素体内注射,取鱼的肾细胞对唇鲮的染色体进行研究.结果表明,唇鲮染色体数目2n=50,其中有4对中部着丝点染色体(m);5对亚中部着丝点染色体(sm);6对亚羰部着丝点染色体(st)和10对端部着丝点染色体(t);其核型公式为2n=8m+10sm+12st+20t,NF=68.与所属的野鲮亚科其他鱼类染色体核型比较,唇鲮是本亚科鱼类中相对原始的类型之一.     

适合于基因组测序的红麻高纯度线粒体DNA提取

采用红麻黄化苗为试材,结合密度梯度离心和差速离心的方法提取线粒体DNA(mtDNA)以满足测序要求.结果表明,蔗糖密度梯度离心法比Percoll密度梯度离心法更适合于红麻线粒体的分离.分离后的线粒体经DNaseI消化核DNA,并采用Jannus绿检测线粒体的完整性,SDS和蛋白酶K裂解线粒体,并用酚/氯仿抽提除去蛋白,...     

青花菜线粒体基因组组装与序列特征分析

为更好地从分子水平了解青花菜,对青花菜进行线粒体基因组组装,并对其序列特征进行分析。青花菜线粒体基因组大小为219 964 bp,GC含量为45.25%。线粒体基因组注释到61个基因,包括33个编码蛋白基因,23个tRNA基因,3个rRNA基因和2个假基因。其中8个基因的核苷酸多样性较高;24个基因无核酸多样性。变异数量最多的基因是 rrn26、 rrn18和 atp1,其变异数量分别为326、277和136。密码子偏好性分析结果显示RSCU值>1的密码子有29个,大多以A/U碱基结尾,表明其密码子更偏向于A/U结尾。基因组序列中共检测到345个重复序列,包括170个正向重复序列和175个回文重复序列。青花菜与花椰菜的线粒体基因组具有极好的共线性,且基因的位置基本一致。青花菜线粒体和叶绿体基因组中共检测到22条同源片段。同源片段总长度为13 355 bp,平均607 bp。     

钱塘江三角鲂线粒体基因组测序及其结构特征分析

为了研究钱塘江流域三角鲂(Megalobrama terminalis Richardson)线粒体基因组结构特征及鲌亚科鱼类的系统进化关系,通过PCR扩增、测序、软件拼接获得了钱塘江三角鲂线粒体基因组全序列,GenBank登录号为MN725725。结果表明,钱塘江三角鲂线粒体基因组序列全长为16 621 bp,碱基组成分别为A(31.23%)、G(16.17%)、C(27.87%)和T(24.73%);共有13个蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因,NAD6、tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser⁽(UCN))、tRNA-Glu和tRNA-Pro等基因编码在L链上,其余基因均在H链上编码。钱塘江三角鲂线粒体基因组全序列与蛋白编码基因的A+T含量分别为55.97%和55.86%,具有明显的AT偏好性。线粒体基因中存在2个散在重复序列,分别位于线粒体控制区中终止结合序列区的前端和控制区3′的末端。在22个tRNA基因中,除了tRNA-Ser⁽(AGY))外,均具有...     

基于454FLX 高通量技术的厚朴叶绿体全基因组测序及应用研究

目的解析高粱泡(Rubus lambertianus)叶绿体基因组特征。方法采用高通量测序技术对高粱泡叶绿体基因组进行测序,经组装和注释后,对其叶绿体基因组进行结构、基因组成及密码子偏好性等特征分析,并使用maximum likelihood 法构建高粱泡与48个悬钩子属及2个路边青属植物的系统发育树。结果高粱泡叶绿体基因组结构为经典四段式结构,其大小为156 266 bp,总GC含量为37.2%,大单拷贝区和小单拷贝区长度分别为85 849和18 855 bp,反向互补重复区长度为25 781 bp,共注释131个基因,包含86个蛋白质编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因。高粱泡叶绿体基因组密码子中有33个以A、U结尾,18个密码子确定为最优密码子;ENC-plot等绘图分析揭示其密码子偏好性更多地受自然选择影响。系统发育树表明：高粱泡与棕红悬钩子亲缘关系最近,其次是蛇泡筋和锈毛莓。结论高粱泡的叶绿体基因组相对较大,且较为保守,并与棕红悬钩子亲缘关系最近。研究结果可为高粱泡乃至悬钩子属植物叶绿体基因组系统进化分析提供重要的理论参考。     

温州光唇鱼线粒体基因组结构及系统发育分析

采用已公布的鱼类线粒体基因组全序列,设计8对引物扩增、测定并注释温州光唇鱼(Acrossocheilus wenchowensis)线粒体基因组(GenBank登录号:KC_495074)。序列全长16 591 bp,包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个非编码区,各基因的位置及组成与已公布的鲤科鱼类一致;37个基因中,1个蛋白质编码基因(ND6)和8个tRNA基因(tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu和tRNAPro)由L链编码,其余的均由H链编码。A、T、G、C碱基组成分别为30.92%、24.86%、16.41%、27.81%;除tRNASer(AGN)外,其它21个tRNA的二级结构均具有典型的三叶草结构;13个蛋白编码基因中,除COⅠ起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子,而COⅡ、ND4和Cytb基因的终止密码子为不完整的T,其它10个基因均具有完整的终止密码子。利用鲤科共17属18种线粒体基因组13个蛋白质基因的氨基酸序列,从线粒体基因组水平探讨了温州光唇鱼在鲤科鱼类中的系统进化地位,为光唇鱼属乃至鲤科鱼类的系统分类学研究提供基础资料。     

基于Solexa平台高通量测序数据的分析与处理流程研究

第二代测序技术的诞生为生物信息学研究带来了前所未有的机遇,同时也对测序数据的处理分析提出了很高的要求。目前针对第二代测序数据的分析软件很多,但是绝大多数软件仅能完成单一的功能,如何正确高效地选择整合这些软件已成为迫切需求。本文基于新一代Illumina/Solexa测序平台所产生的数据,构建了一套完整的数据处理和分析流程,实现对测序数据有效分析和处理。对数据处理过程中所用的软件和方法做了全面综述,并对生物信息数据处理研究中存在的难题做了进一步展望。     

基于高通量测序的动物基因组研究进展

动物基因组学研究是进行动物遗传资源保护和利用以及分子育种的一项重要基础工作,高通量测序技术的出现为动物基因组学研究带来了革命性飞跃。文章对基于高通量测序技术的动物基因组从头测序、重测序、简化基因组测序等基因组学研究进行了综述,总结了相关的生物信息分析内容,并对不同分析工具及方法进行了比较分析。最后,讨论了当前高通量测序技术存在的问题,对该技术未来发展方向进行了展望。     

一种用于桑RAD-Seq高通量测序的基因组DNA提取方法

[目的]筛选一种能够得到高质量桑树基因组DNA的方法。[方法]采用天根试剂盒法(Plant Genomic DNA Kit离心柱型),并稍加改进,从11个桑种的新鲜嫩叶中提取DNA。[结果]该方法简单快速,不需要复杂仪器,且能有效地除去桑叶中的多糖、多酚、蛋白质等杂质,得到的DNA能够满足RAD-Seq高通量的测序要求。[结论]建立了一种用于桑RAD-Seq高通量测序的基因组DNA提取方法。     

基于高通量测序的技术检测梨树病毒

【目的】 研究运用基于高通量测序的技术检测梨树病毒,为梨树病毒的检测提供新方法。【方法】 于2014年、2017年、2018年4月中旬采集库尔勒香梨花朵若干,分别进行转录组测序,将得到的序列经过转录本拼接、层次聚类和基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的序列作为候选病毒序列。利用RT-PCR方法检测随机采集的香梨枝条样品,验证高通量测序结果的可靠性。【结果】 根据3组转录组测序数据的生物信息学分析结果,分别对注释为来源于植物病毒的66、202和921条基因序列进行分析。3种梨树中已报道的病毒,分别是苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒,以及梨树中未报道的芸薹黄化病毒。采用设计的特异性引物,通过RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,结果扩增出苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的目的片段。【结论】 高通量测序技术可作为检测梨树病毒的一种快速、有效手段。