H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2012年10月,在江苏省已进行过禽流感疫苗免疫的某肉鸡养殖基地,出现了一种以严重呼吸障碍、气管栓塞、突发死亡为特征的疾病。取典型病例鸡脑、肺脏、脾脏、咽拭子和泄殖腔拭子,经过初步处理后,接种于9日龄SPF鸡胚,经过培养纯化,获得一株病毒。通过血凝试验、血凝抑制试验和分子生物学试验以及动物回归试验等研究,最终确诊该病为H9亚型禽流感,分离的病毒为H9亚型禽流感病毒。     

支气管炎型H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

广东省某鸡场发生一起以严重呼吸困难、急性死亡为特征的病例,5000只鸡在1周内连续死亡400多只。通过病理剖检,几乎所有病死鸡支气管都充满干酪样物质,导致支气管严重阻塞,气管及支气管黏膜严重出血。采集病死鸡的肝脏、脾、肺和气管干酪样物质,病料经处理后通过SPF鸡胚绒毛尿囊膜接种获得一株病毒。通过琼脂凝胶免疫扩散(AGP)试验,该病毒能与禽流感标准阳性血清形成明显沉淀线,初步确定该病毒为禽流感病毒;通过血凝HA试验,该病毒能够凝集鸡红细胞,但此血凝现象不能被抗NDV血清、抗EDSV-76血清、抗H 5亚型流感单因子血清、抗H 7亚型流感单因子血清所抑制,而能被抗H 9亚型禽流感单因子血清所抑制,以及通过H 9亚型流感病毒的RT-PCR分子生物学诊断方法,最终确诊该病毒为H 9亚型禽流感病毒。动物回归试验,攻毒鸡表现与临床发病鸡一致的症状及典型病理变化,患鸡支气管被干酷样物严重阻塞,气管、支气管黏膜较严重出血,通过病料的病毒分离与鉴定,能再次分离到该病毒。     

草鸡源H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2010年4月,安徽省某草鸡养殖场发生一起以严重呼吸困难、急性死亡为特征的病例。取发病典型的鸡内脏,按常规方法处理后,接种10日龄SPF鸡胚,经有限稀释法纯化,获得一株病毒,通过HA、HI、分子生物学以及动物回归等试验,最终确诊该病为H9亚型禽流感。     

H9N2亚型鸡源禽流感病毒分离与鉴定

禽流感 (AI)又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟 ,是由正粘病毒科 A型流感病毒引起的一种传染病 ,是国际兽医局规定的 A类烈性传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及其他野禽均可感染。我们从新乡市某蛋鸡场分离鉴定 1株低致病力的 H9N2亚型的禽流感病毒毒株 ,现报告如下。1　材料与方法1.1　材料　病料来自河南职业技术师范学院禽病研究所接诊检验的病、死鸡。禽流感 A型琼扩抗原、标准阳性血清以及抗 HA、NA分型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所 ;抗新城疫 (ND)血清和抗减蛋综合征 (EDS- 76 )血清由本院禽病研究所提供。 SPF鸡胚和雏鸡购自…     

呼吸道病型H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

广东省某鸡场发生一起以严重呼吸困难症状、急性死亡为特征的病例,5 000羽122日龄清远麻鸡在一周内连续死亡400多羽。剖检后几乎所有病死鸡支气管充满干酪样物质,导致支气管严重阻塞,气管及支气管黏膜严重出血。病料接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜获得一株病毒。通过AGP试验,该病毒能与禽流感标准阳性血清形成明显沉淀线;通过HA试验,该病毒能够凝集鸡红细胞,但此血凝现象不能被抗NDV血清、抗EDSV-76血清、抗H5亚型流感单因子血清、抗H7亚型流感单因子血清所抑制,而能被抗H9亚型禽流感单因子血清所抑制;进而通过RT-PCR方法,最终确诊该病毒为H9亚型禽流感病毒。动物回归试验,攻毒鸡表现与临床发病鸡一致的症状及病理变化,并能再次分离到该病毒。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

为了获得H9亚型禽流感病毒(AIV)流行毒株并掌握流行毒株的分子特征和致病性,采用病毒分离、血凝性试验、鸡胚半数感染量(EID50)测定、HA基因序列分析、致病性试验、交叉保护性试验等对3份临床疑似H9亚型AIV感染病料进行了研究.结果:3份临床病料样品可引起10日龄SPF鸡胚规律性死亡,3株分离毒株对1％鸡红细胞的凝...     

一株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物特性研究

2013年中国吉林某养鸡场发生疑似H9亚型禽流感疫情,采集该发病鸡场病料接种9日龄SPF鸡胚,分离得到一株病毒。经血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、测序分析,鉴定该毒株为H9亚型禽流感病毒(AIV)。对本试验分离株HA基因进行测序及序列分析,结果显示分离株HA基因的裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的基因特征;HA肽链具有9个潜在糖基化位点,与近些年H9亚型AIV分离株的潜在糖基化位点相同;具有8个受体结合位点,其中234位受体结合位点由谷氨酰胺(Q)变异成苏氨酸(T);HA基因系统进化树结果显示本试验分离株属于欧亚进化分支,与中国最早分离株A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)亲缘关系较远,与2007年后中国H9亚型AIV主要流行分支的代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)亲缘关系较近。将该毒株制成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后第21天免疫鸡血清抗体高达10log2,表明本试验分离株具有很好的免疫原性。     

H6亚型禽流感病毒的分离鉴定与生物学特性分析

为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。     

一株普通鵟源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从深圳野生鸟类救护基地的1只普通鵟的泄殖腔拭子中分离到1株禽流感病毒,将该禽流感病毒进行鸡胚接种和HA、HI试验鉴定、HA基因扩增及测序分析,并进行致病性试验。结果表明,该分离株为H9N2亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Wild bird/Guangdong/SZ-YN05/2015(H9N2)。进化分析显示,该毒株属于4.2.1分支,与SS/94株同源性较低,与A/Chicken/Shandong/GM-TH/2014(H9N2)的遗传距离最近。同时以血凝价HA 8log2病毒尿囊液稀释200倍静脉注射接种感染4周SPF鸡,感染3d后从心、肝、肺、肾、气管、咽及肛分别检测到病毒,感染7d后从心、肝、肺、肾、气管均未分离到病毒,咽部病毒分离率2/6,肛部病毒分离率3/6。     

H9N2亚型禽流感病毒TJ1株的分离与鉴定

从发病蛋鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒TJ1株,对其进行了系统的生物学特性鉴定.结果表明,分离毒TJ1株具有血凝性,且凝集不被新城疫和产蛋下降综合征抗血清抑制,而被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清抑制,禽流感琼扩试验结果为阳性,在电镜下呈典型的流感病毒粒子形态,证明该毒株为A型流感病毒;通过致病力试验,分离毒TJ1株对6周龄SPF鸡无致病性,为低致病性毒株;用其制备成油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡,能很快产生对H9特异的血凝抑制抗体,于免疫后3周攻毒,可以保护雏鸡抵御同病毒攻击的感染,表明分离毒TJ1株具有良好的免疫原性.     

H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量（EID₅₀）为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间（MDT）为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.4.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。     

湖北地区鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了分离鉴定病鸡排泄物中的禽流感病毒,并分析其遗传背景,通过鸡胚接种试验区和病毒特异性抗体中和试验区,从病鸡排泄物中分离鉴定出2株禽流感病毒,分别命名为A/chicken/Jinmen/JM0305/2017(JM0305)和A/chicken/Daye/DY0602/2017(DY0602)。利用禽流感病毒亚型特异性抗体中和试验区和基因测序分析等方法对2株禽流感病毒进行亚型鉴定。结果表明,2株禽流感病毒均属于H9N2亚型。为了解这2株H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性,对其全基因组进行了分析以及毒力测定。结果显示,将2株毒株感染雏鸡后,未产生明显的禽流感临床症状,2株H9亚型禽流感病毒的MDT值分别为72.0h和91.2h,HA裂解位点处的氨基酸序列均为-PSRSSR/GL-,表明2株禽流感病毒均属于低致病性禽流感。遗传进化分析表明2株病毒的HA基因均在H9亚型分支上,NA基因均在N2亚型的分支上;通过进化树分析表明2株病毒属于以A/chicken/Beijing/1/94(H9N2)为代表的欧亚谱系。该结果为进一步研究鸡源H9N2亚型禽流感病毒分子进化奠定了基础。     

鸭源H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

从广东各地鸭群的392份泄殖腔样本中分离到3株病毒。用琼脂扩散试验(AGP)及血凝抑制试验(HI)证实3个分离株均为H9亚型禽流感病毒(AIV)。3个AIV分离株都能凝集人、鸡、山羊、豚鼠、兔的红细胞,但不能凝集猪红细胞;所有分离株血凝素(HA)对热不稳定;60℃加热处理10 m in后,病毒失去对鸡胚的感染性;3个AIV分离株的半数鸡胚感染剂量(E ID50)分别为107.2/0.2 mL、105.8/0.2 mL和106.1/0.2 mL。     

禽流感病毒H5、H9亚型的多重RT-PCR鉴别诊断

根据禽流感病毒H5、H9亚型的HA基因序列,设计了两对RT-PCR引物,同时对H5、H9亚型进行了多重RT-PCR扩增,得到了两条清晰的目的带.将目的带回收并进行测序,同源性比较结果证明其为禽流感H5、H9亚型的HA基因序列,作者对多重RT-PCR进行反应条件优化以及敏感性与特异性测定,证明该方法的敏感性和特异性都比较好.初步应用于30份临床病料,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,可用于禽流感病毒H5、H9亚型的鉴别诊断.     

两株H9亚型鹅流感病毒的分离和鉴定

禽类流感病毒（Avian influenza viruses）与人类流感病毒都属于正黏病毒科，二者关系密切。一方面，禽流感病毒为20世纪暴发的3次人类流感大流行提供丁所必需的基因。另一方面，禽流感病毒也可以直接感染人。例如：1997年香港和2004年初的泰国、越南H5N1亚型禽流感导致多人死亡。H9亚型流感病毒1966年首次从北美的火鸡分离。H9亚型禽流感虽然尚未有导致人类死亡的报道，但是该亚型病毒对动物和人的威胁正在增加。     

1株鸡H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和HA基因序列分析

从广东珠三角地区某鸡场采样,接种SPF鸡胚后分离到一株病毒,经HA和HI检验为禽流感病毒H9亚型阳性,命名为A/chicken/Guangdong/JL/2014(简称为JL)。HA基因测序后分析显示,JL株HA基因、蛋白与近年来国内流行的GX55等4.2.5分支H9亚型禽流感病毒相似性高,分别为90.9%~97%和93.4%~99.5%,而与国内常用疫苗株SS、F、SD696等4.2.3分支病毒相似性较低,分别为85.8%~88.1%和88.4%~89.1%,其中与RZ853株相似性最高,达97%。试验表明,分离的JL株属于4.2.5分支,与近年来国内流行株类似,与常用疫苗株存在一定差异。     

H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在,给养禽业造成巨大的经济损失,并危害人类健康。流感病毒抗原易发生漂移和转换,使流感病毒的防控变得困难。疫苗接种是防控禽流感最有效的手段之一,全病毒灭活疫苗保护效果好,制备简单,是流感病毒常用的疫苗,但该疫苗局部副反应大,并伴随生物安全问题。随着分子生物学技术的发展,活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的开发,给H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控方面具有广泛的优势,是流感病毒疫苗发展的新方向。     

禽流感H9亚型病毒WD株毒种的纯化研究

采用鸡胚终点稀释法并结合ND抗血清中和法对禽流感H9亚型病毒WD株毒种进行了纯化。将纯化的WD株毒种在SPF鸡胚连续传12代，对各代次毒种进行了毒价测定，选择一定代次的毒种进行了免疫原性试验及外源病毒检验。结果表明，WD株在鸡胚中连续传12代，其HA价稳定在1：512—1：1024，毒价在10^7.0-10^8.3 EID50／0．1mL；不同代次毒种不含外源病毒，免疫原性均符合要求。由此可见，毒种的纯化方法是有效的，将WD株毒种限制在12代内是可行的，并建立了该毒种的种子批。