空怀期陕北白绒山羊母羊蛋白质需要量研究

【目的】研究空怀期陕北白绒山羊的蛋白质需要量,为建立和完善陕北白绒山羊饲养标准提供基础数据。【方法】将体质量相近、健康状况良好的24只第2胎次空怀期陕北白绒山羊母羊随机分成4组,各组试验羊分别饲喂消化能水平均为NRC(1981)肉用和奶用山羊推荐维持需要量的1.2倍、粗蛋白质水平分别为NRC(1981)肉用和奶用山羊推荐维持需要量的80%,90%,100%和110%饲粮,进行为期66d的饲养试验(其中预试期7d);同时在试验中期(第25天),每组选择3只羊按照全收粪、尿法进行为期7d的消化代谢试验。【结果】(1)空怀期陕北白绒山羊母羊对4种日粮粗蛋白质的表观消化率差异不显著(P0.05),平均为(65.54±0.43)%;(2)供试羊平均日增质量随日粮粗蛋白质和可消化粗蛋白质摄入量的增加呈近似于直线的变化(P0.05),其相关系数分别为0.989 6和0.982 5。【结论】建立了空怀期陕北白绒山羊母羊粗蛋白质(CP)和可消化粗蛋白质营养需要量(DCP)与代谢体质量(W0.75)和平均日增质量(ADG)间的回归方程,确定了空怀期陕北白绒山羊母羊饲粮中粗蛋白质和可消化粗蛋白质水平(以风干样为基础)分别以8.29%～10.43%和5.43%～6.83%较为适宜。     

陕北白绒山羊Lhx2基因cDNA序列的克隆与原核表达

根据GenBank中已发表的Lhx2基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从陕北白绒山羊皮肤组织克隆Lhx2基因编码区cDNA,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-Lhx2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。最终获得陕北白绒山羊Lhx2基因,长1 221bp;酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-Lhx2构建成功;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。     

陕北白绒山羊DGAT1基因外显子14多态性及其与部分生长和胴体性状的关系

【目的】探讨陕北白绒山羊DGAT1基因的SNPs及其与部分生长、胴体性状的相关性,为陕北白绒山羊分子标记辅助选择提供理论依据。【方法】测定234只陕北白绒山羊的部分生长、胴体指标,利用PCR-SSCP技术分析其DGAT1基因外显子14的多态性及与生长和胴体性状的关系。【结果】该座位存在一个突变位点(G→A),此SNPs导致甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E);该群体的该位点有1对等位基因A和B以及3种基因型AA、AB和BB,A基因为优势等位基因,AA型为优势基因型,群体处于Hardy-Weinberg非平衡状态;AA型与BB型之间、AB型与BB型之间均在断奶重、周岁重、胸围和管围4个性状上差异极显著(P<0.01),但AA型与AB型之间在此4个性状上差异不显著(P>0.05);3种基因型间在其他性状上差异均不显著(P>0.05);在初生重、周岁重和胸围上均表现为BB型>AA型>AB型,在断奶重、体高和管围上均表现为BB型>AB型>AA型。【结论】该基因的此突变位点与绒山羊育种指标具有一定的相关性,通过提高BB型的频率可望改善绒山羊的生长发育及胴体性状;DGAT1基因可作为陕北白绒山羊生长及胴体性状的候选基因,也可作为绒山羊肉用性能的分子标记。     

内蒙古白绒山羊GHR和GDF9基因多态性及其与生产性状的相关性分析

【目的】探究生长激素受体(GHR)和生长分化因子9(GDF9)基因多态性与内蒙古白绒山羊生产性状的相关性。【方法】采集452只阿拉善品系内蒙古白绒山羊雌性个体(其中包括382只18月龄左右的育成羊和70只36月龄左右的成年羊)的耳组织并测定其体质量和体尺数据。提取试验羊耳组织的DNA,通过InDel分型和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定出452只内蒙古白绒山羊GHR和GDF9基因的多态性,利用SPSS 23.0分析软件探讨其与生产性状的相关性。【结果】在内蒙古白绒山羊GHR基因第1内含子中检测到9-bp插入缺失标记(InDel)位点(NC_022312:g.42801_42809delCTGTGGCAT),该位点属于低度多态(PIC0.25)且处于哈代-温伯格平衡状态(P0.05);在GDF9基因3′调控区检测到12-bp InDel位点(NC_022299.1:g.66028950insTACTTTCAACAA),该位点属于中度多态(0.25PIC0.50)且处于哈代-温伯格非平衡状态(P0.05),2个InDel位点均存在纯合插入型、杂合型和纯合缺失型3种基因型。在育成羊中,GHR基因第1内含子中9-bp InDel位点纯合插入基因型个体体质量、体长、胸围和胸宽均值显著大于杂合基因型个体(P0.05);在成年羊中该位点两种基因型间各生长指标差异不显著(P0.05)。在育成羊中,GDF9基因3′调控区12-bp InDel位点杂合基因型和纯合缺失基因型个体体质量、体高和胸围均值极显著大于纯合插入基因型(P0.01);在成年羊中,GDF9基因该InDel位点纯合插入基因型个体体质量、胸围和管围均值显著大于纯合缺失基因型(P0.05)。【结论】GDF9基因3′调控区12-bp InDel位点和GHR基因第1内含子中9-bp InDel位点多态性与内蒙古白绒山羊体质量和部分生长性状具有显著或极显著的相关性。     

KRTAP1-4基因多态性对陇东绒山羊羊绒性状的影响

【目的】研究角蛋白关联蛋白1-4基因（KRTAP1-4）多态性对陇东绒山羊羊绒性状的影响。【方法】以382只1岁龄陇东绒山羊为研究对象,测定其产绒量、绒层高度和绒纤维的平均直径。采集试羊皮肤、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏组织及血样,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测KRTAP1-4基因在6个组织中的表达谱;采用聚合酶链反应 单链构象多态性（PCR-SSCP）检测KRTAP1-4基因的多态性,分析3个羊绒表型性状间的Pearson相关性及KRTAP1-4基因型与羊绒性状间的相关性。【结果】RT-PCR发现,KRTAP1-4基因只在陇东绒山羊的皮肤中表达。在陇东绒山羊KRTAP1-4基因上检测到A、B、C、D 4个等位基因和AA、AB、AC、AD、BB 5种基因型。测序结果表明,山羊KRTAP1-4基因上有1个插入/缺失位点（c.223_252insTGCCAACCGATCTCCATCCAGACCAGCTGC）、2个同义突变的单核苷酸多态性（c.333T> C和c.573C> T）,以及1个Chi序列（c.14－c.21,5′-CCACCAGC-3′）和2个Chi-like序列（c.46－c.53,5′-ACTGGTGG-3′;c.392－c.399,5′-GCACCAGC-3′）。Pearson相关性系数显示,产绒量与平均纤维直径（r=0.324,P<0.001）及绒层高度（r=0.465,P<0.001）呈中等正相关,平均纤维直径与绒层高度呈弱的正相关（r=0.201,P<0.001）。相关性分析结果表明,AA、AB和AC型山羊个体的产绒量和绒层高度极显著低于BB型个体（P<0.01）。【结论】KRTAP1-4基因可以作为产绒量和绒层高度的分子标记用于陇东绒山羊的育种实践中。     

对陕北白绒山羊种质资源保护的建议

绒山羊是我国畜禽遗传资源第一类保护的资源,陕北白绒山羊是我国第一个优秀的培育品种,该品种绒色洁白,手感柔软,纤维细长,细度在15微米以下．自然长度5厘米以上的个体占到81．2％,为国内羊绒纤维的上品。     

西藏绒山羊羊绒细度候选基因筛选及其chi-miR-105a靶基因的验证

为研究西藏绒山羊羊绒细度,以及了解相关候选基因对绒山羊产绒性能的影响,本研究对筛选chi-miR-105a靶基因进行验证,以西藏绒山羊为研究对象,联合RNA测序数据和蛋白质组学数据,筛选与羊绒细度相关的关键候选基因,并通过实时荧光定量和双荧光素酶报告基因试验对候选基因进行调控作用验证。结果表明:1)通过转录组和蛋白组数据整理得到384个DE mRNAs,12个DE miRNAs和29个DEPs。通过多组学联合分析发现CXCL10、SRC、CXCL9、FOS、ETV6、GMPS和PIP5K1B基因与羊毛细度相关。2)通过DEG-DE miRNA互作网络图发现chi-miR-105a与靶基因ETV6和PIP5K1B均在网络当中出现。因此对该调控因子进行验证和分析,根据靶基因表达水平试验发现转染chi-miR-105a mimics后引起毛乳头细胞中ETV6基因的mRNA表达显著降低(P<0.001),而PIP5K1B基因的表达量均无显著变化。3)通过双荧光素酶报告基因试验表明,过表达chi-miR-105a后,ETV6酶活性显著降低,即chi-miR-105a可与ETV6的3′UTR区结合。综上,通过多组学联合分析筛选出与羊毛细度相关基因CXCL10、SRC、CXCL9、FOS、ETV6、GMPS和PIP5K1B。通过双荧光素酶报告基因进行chi-miR-105a与其预测靶基因ETV6和PIP5K1B的靶标验证,确定chi-miR-105a是ETV6潜在的调控因子,本研究为加快优质绒山羊新品种(系)的培养提供理论依据。     

转VEGF和转Tβ4基因陕北白绒山羊粪便中菌群分析

以转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊与野生型陕北白绒山羊为研究对象,采集其新鲜粪便样品,用灭菌生理盐水进行梯度稀释后,分别接种LB固体培养基、TPY琼脂、胆硫乳琼脂、肠球菌琼脂、伊红美蓝琼脂和甘露醇盐琼脂培养基,37℃恒温过夜培养,再分别对平板上生长的所有需氧菌、双歧杆菌、沙门氏菌、肠球菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌进行菌落计数,并做显著性检验分析。结果表明,转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊与野生型陕北白绒山羊粪便中的需氧菌菌群结构之间不存在显著性差异。研究结果为转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊安全性评价研究提供了试验数据和研究基础。     

红麻线粒体基因NAD3和COB的RNA编辑与表达分析

以红麻细胞质线粒体近等基因系UG93A(不育系)、UG93B(保持系)及UG93A×福红992(恢复系)的F1代为材料,研究花药线粒体基因NAD3和COB的转录与表达。结果发现,在3种供试材料中,基因NAD3的CDS区在DNA水平和RNA编辑水平上均无差异;不育系与保持系的COB基因DNA编码序列无差异,但在RNA水平上发生了编辑,8个位点的编辑均发生于密码子的第一或第二位碱基,且导致氨基酸种类变化,主要为亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸;COB基因在UG93A中的RNA编辑频率低于UG93B;NAD3和COB基因在3种材料中的转录本大小基本相同,但在表达水平上表现为不育系显著低于保持系和F1代。由此推测NAD3和COB基因在红麻花药发育过程中有着重要的作用。     

甘薯抗草甘膦生理指标及其相关基因EPSPS和AKR的表达

【目的】研究草甘膦胁迫下甘薯生理指标以及EPSPS和AKR 2个基因相对表达水平的变化,探讨甘薯耐草甘膦的分子机制。【方法】选取对草甘膦敏感性不同的2个甘薯品种N3589(草甘膦敏感型品种)和鄂薯11(草甘膦抗性品种)为试验材料,以喷施清水为对照,研究喷施草甘膦后甘薯莽草酸和脯氨酸含量及根系活力的变化,以及EPSPS和AKR基因的表达情况。【结果】与喷施清水对照相比,喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589叶片的莽草酸含量显著升高,草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的莽草酸含量升高不显著;2个品种甘薯块根和叶片的脯氨酸含量均显著升高;植株的根系活力均显著降低。q-PCR结果显示,在喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589的EPSPS基因显著下调,AKR基因先上调表达后下调表达;而草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的EPSPS基因显著上调,AKR基因先下调表达后上调表达。【结论】甘薯耐草甘膦主要是因为喷施草甘膦之后,EPSPS基因迅速上调表达,从而减少体内莽草酸累积对植株造成的伤害;与此同时,喷施草甘膦后AKR基因迅速上调表达,参与了甘薯体内草甘膦的代谢。     

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCRRFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%（123/180）,囊胚发育率为25.20%（31/123）;在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60 d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。     

LEPR基因在贵州白山羊组织中的表达

为探究瘦素受体基因(LEPR)在贵州白山羊组织中的表达规律,利用实时荧光定量PCR技术检测LEPR基因在贵州白山羊心、肝、脾、肺、肾、肠、背肌、腿肌和皮下脂肪9个组织的表达量。结果表明:目的基因LEPR和内参基因GAPDH的熔解曲线均呈单一峰形,说明所选条件可准确定量LEPR基因在贵州白山羊各组织中的相对表达量。具体表达量为脂肪脾肺背肌肠肝肾心腿肌。     

天祝白牦牛KA P1.1 基因的克隆及生物信息学分析

以牦牛的角蛋白关联蛋白1.1（KAP1.1）基因为研究对象,根据GenBank收录的黄牛KAP1.1基因的mRNA序列（登录号:NM₀01105369.1）设计特异性引物,通过反转录PCR、PCR以及克隆方法首次获得牦牛的KAP1.1完整CDS区,将所得序列提交到NCBI,登录号为KJ095199,并对其进行生物信息学分析。结果表明,牦牛KAP1.1基因的CDS区全长为501bp,共编码166个氨基酸;编码的蛋白质属于亲水性蛋白质。二级结构含有α螺旋区、延伸链、β转角和无规卷曲4种。氨基酸序列与黄牛的同源性最高,具有High sulphur keratin-associated protein家族蛋白的完整结构域。     

内蒙古绒山羊Homeobox基因片段的克隆与序列分析

根据已公布的Hom eobox基因氨基酸序列保守区设计简并引物,利用PCR技术从内蒙古绒山羊血液基因组DNA中扩增Hom eobox基因家族成员。目的基因片段纯化后连接到pGEM-T载体上,经鉴定得到重组质粒。将110个重组质粒进行测序,测序结果通过与GenBank中序列比对分析,确定86条序列为Hom eobox基因,得到14个Hom eobox基因家族成员:Hoxa4,Hoxa5,Hoxa6,Hoxa7,Hoxb1,Hoxb2,Hoxb3,Hoxb6,Hoxb7,Hoxc6,Hoxd1,Hoxd3,Gbx1,Gbx2。每个基因片段由117个核苷酸组成,编码39个氨基酸。氨基酸序列非常保守,和其他物种的同源性非常高。     

4个绒山羊群体i<>KAP13-1基因的遗传多态性分析

【目的】对中国河西绒山羊、内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊和陇东绒山羊4个绒山羊群体KAP13-1基因的遗传特征进行分析,为揭示绒山羊遗传特征和生产利用提供基础数据。【方法】采用PCR-SSCP方法,检测河西绒山羊、内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊及陇东绒山羊(共721只)KAP13-1基因的多态性。同时基于DA遗传距离用UP-GMA法进行聚类分析,以明确各群体间的遗传关系。【结果】基因组DNA扩增后得到491bp的扩增产物,经SSCP分析,从4个绒山羊群体KAP13-1基因中共发现6种基因型,4个等位基因中存在5个变异位点,这些多态位点主要为点突变,且均处于编码区,其中转换位点3个(占60%),颠换位点2个(占40%)。在170和197位分别发生了T→G、C→G的错义突变,导致氨基酸分别由Leu、Thr变为Arg、Ser。该基因在河西绒山羊与陇东绒山羊中均存在4个等位基因,而内蒙古绒山羊未检测到C和D等位基因,辽宁绒山羊未检测到D等位基因。聚类结果显示,河西绒山羊与陇东绒山羊之间的遗传距离较小,在系统发生树中聚为一支,辽宁绒山羊与内蒙古绒山羊聚为一支。【结论】KAP13-1基因在4个绒山羊群体中呈中度多态,群体间存在差异。生态学作用对4个绒山羊品种的进化过程有一定的影响。     

Hoxc13基因在苏博美利奴羊胎羔生长发育期不同组织中的表达分析

【目的】分析苏博美利奴羊不同组织中Hoxc13基因mRNA的表达量差异,为分子标记辅助育种以及,研究细毛羊主要经济性状,奠定理论基础。【方法】使用RT-PCR技术检测Hoxc13基因在苏博美利奴羊65和135 d皮肤、肌肉和不同内脏组织(心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏)中mRNA的表达量,并采用相对定量法对其表达量进行统计分析。【结果】在苏博美利奴羊皮肤、肌肉和不同内脏组织中均有Hoxc13基因的表达,并且在皮肤中的表达量显著高于其它组织(P<0.05),毛囊的形成和毛发生长与Hoxc13基因密切相关。【结论】建立了胎龄分别在65和135 d的苏博美利奴羊,其不同组织中适于定量检测的Hoxc13基因表达量的RT-PCR方法,从分子水平探讨了苏博美利奴羊的组织器官与Hoxc13基因表达之间的内在联系。     

辽宁绒山羊抑制素A基因遗传变异与双羔性状的关联分析

以抑制素A基因(Inhibin alpha subunit gene,INHA)作为辽宁绒山羊双羔性状的候选基因,以便为绒山羊育种工作中分子标记选择提供理论依据。运用测序法寻找辽宁绒山羊INHA基因单核苷酸多态性,筛查到一个新的多态位点-446TC,该位点位于INHA基因的启动子区域。运用PCR-RFLP法验证并分析该位点在辽宁绒山羊双羔群体和单羔群体间的多态性。结果表明,在辽宁绒山羊中双羔和单羔群体中分布A、B两个等位基因,处于中度多态。经χ2检验,样本在该位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05),不同基因型在辽宁绒山羊单、双胎群体上差异达到显著水平(P0.05)。