大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶accD亚基表达载体的构建及遗传转化研究

为探索大肠杆菌异质型乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的β-CT亚基accD基因对油料作物含油量的影响,将目的基因E.coli accD（eaccD）与拟南芥Rubisco小亚基（rbcS）转运肽基因融合,构建以油菜Napin启动子驱动的种子特异表达载体。本试验应用农杆菌介导法,将该表达载体转入油菜,通过PCR检测获得了...     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

甘蓝型油菜SAMDC3基因及其启动子的克隆与分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是植物体内亚精胺和精胺前体物质形成的关键酶。本研究克隆了甘蓝型油菜（Brassica napus）BnSA MDC3基因家族2个成员的全长cDNA和启动子序列,并对其诱导表达特性进行了鉴定。BnSAMDC3—1（GenBank accession No．HM013966）和BnSAMDC3—2（GenBankac．cession No．HM013967）的全长cDNA分别为1746bp和1754bp,开放阅读框（ORF）长度分别为1101bp和1104bp,在大ORF上游132bp处均包含一个171bp的小ORF。BnSAMDC3基因在叶片中表达量较高,受高温和干旱抑制。6-BA、GA,和SA抑制BnSAMDC3—1的表达,而GA,和甘露醇诱导BnSAMDC3—2表达上调。BnSAMDC3基因启动子具有多个与胁迫和激素诱导相关的顺势调控元件,表明BnSAMDC3可能通过ABA、6-BA和SA信号途径介导植物对非生物胁迫的响应。本研究将有助于进一步探讨甘蓝型油菜抗逆的分子机理,为甘蓝型油菜的栽培和品质改良奠定基础。     

普通小麦背景中长穗偃麦草高分子量麦谷蛋白基因的表达、染色体定位与分子标记

摘要：以普通小麦（Triticum aestivum）中国春、长穗偃麦草?穴Thinopyrum elongatum ?雪及其双二倍体、二体异附加系、二体异代换系为材料，采用SDS-PAGE分析了种子高分子量麦谷蛋白亚基。长穗偃麦草高分子量麦谷蛋白基因在中国春背景中编码一条高分子量麦谷蛋白亚基，其迁移率与中国春1By8亚基相同，命名为1E8亚基，控制该亚基的基因位点Glu-E1位于长穗偃麦草E组染色体第一同源群的长臂上。用高分子量麦谷蛋白y亚基基因重复区域的特异引物进行扩增，长穗偃麦草1E8亚基编码基因（Glu-E1）扩增出1 300 bp的片段，而中国春1By8亚基编码基因（Glu-B1y）扩增出1 950 bp的片段。     

甘蓝型油菜沪油15中BnaRAV-2-HY15转录因子的克隆及表达分析

基于拟南芥RAV类转录因子的序列,通过电子克隆的方法获得甘蓝型油菜的BnaRAV-2基因序列,再利用RT-PCR方法从甘蓝型油菜沪油15中扩增出编码RAV类转录因子基因BnaRAV-2-HY15,并进行了序列和进化分析。结果显示,该转录因子基因长1119 bp,编码372个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子的结构特征。BnaRAV-2-HY15 和AtRAV2具有相似的三维结构。采用半定量RT-PCR方法对基因表达水平进行分析,发现BnaRAV-2-HY15受到PEG、高盐和低温的诱导表达。BnaRAV-2-HY15基因在沪油15盛花和籽粒发育时期的根、茎、叶、花、蕾和荚中均检测不到明显的表达。     

一个在超饲养朗德鹅肝脏中差异表达基因的分离和鉴定

为阐明鹅（Anser anser）肥肝形成的机制,使用mRNA差异显示技术研究超饲养和正常饲养条件下朗德鹅肝脏基因表达差异。基因转化生长因子β2(TGFB2)被证实在肥肝中上调（P < 0.01）,该基因1 248 bp的cds序列(GenBank 登陆号EF541127)与鸡TGFB2有94%的同源性。序列分析表明,该序列含有一个1 239 bp的开放读码框架（ORF）,编码412个氨基酸的蛋白质,该蛋白质序列存在2个保守的功能域：引导序列（TGFb前肽）和功能结构域（TGFβ）,并与其它同源蛋白有较高的同源性。应用生物信息学方法对该蛋白质的功能和结构进行了分析。组织表达分析表明,鹅TGFB2在肝、肌胃、脾和卵巢中表达丰富,在子宫、肺和肌肉中中等表达,在肾和腹脂中表达量较低。结果显示,超饲养诱导了鹅肝脏TGFB2基因mRNA表达水平的上调。     

抑制素βA基因PCR-SSCP多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系的研究

采用PCR-SSCP技术检测抑制素βA亚基基因（inhibin βA，INHBA）的编码区在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊、安哥拉山羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果发现4对引物中只有P4扩增片段有多态性，其余3对引物的扩增片段均不存在多态性。P4扩增片段在济宁青山羊和安哥拉山羊中检测到AA、AB和BB 3种基因型，在内蒙古绒山羊中检测到AB和BB两种基因型。测序分析表明BB型与AA型相比在外显子2的第80 bp处有一个T→C突变，并引起氨基酸改变（脯氨酸→亮氨酸）。济宁青山羊AA、AB和BB基因型频率分别为0.4786、0.4143和0.1071。AA基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值比AB基因型的多0.42只（P<0.05），比BB基因型的多1.14只（P<0.001）；AB基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值比BB基因型的多0.72只（P<0.05）。     

西兰花表皮特异硫蛋白基因的克隆与表达分析

表皮特异硫蛋白在硫代葡萄糖苷代谢调控中起着重要作用,包括催化异硫氰酸酯生成环腈类和腈类物质。本研究以西兰花为试验材料,在克隆表皮特异硫蛋白基因BoiEPS的基础上进行序列分析和表达分析,并初步明确其在野油菜黄单胞菌侵染下的功能。结果表明,BoiEPS基因全长1 270 bp,有1个长度为238 bp的内含子;编码区全长1 032 bp,编码343个氨基酸,编码蛋白具有2个Kelch结构域。系统发育分析结果表明,BoiEPS与来自芜菁、甘蓝型油菜的EPS聚为一组,但与其他十字花科植物的EPS处于不同分支。实时荧光定量PCR结果表明,BoiEPS的表达受野油菜黄单胞菌的诱导,在24 h的表达量最大;BoiEPS的过量表达可显著提高西兰花对黑腐病的抗性,病程相关蛋白基因BoPR1的表达量在3个过表达株系均明显增加。本研究结果为后续开展西兰花-黑腐病抗性机理研究奠定了理论基础。     

牦牛MT-I和MT-Ⅲ基因cDNA3’末端全长的克隆与序列分析

分别利用基因特异引物YMr-ISP、Ymr-ⅢSP和M13引物M4，通过RT-PCR和3＇-RACE方法从牦牛（Bos grunniens）肝脏和大脑组织RNA中分别扩增并克隆出了牦牛Metallothionein-I（MT-I）和Metallothionein-Ⅲ（MT-Ⅲ）cDNA3’末端全长序列（分别为331和378bp，GenBank登录MT-I No．AY758557，MT-Ⅲ No．DQ492300），其中分别包含MT-I，基因编码区全长（183bp）、MT-Ⅲ基因编码区全长（207bp），同时在MT-I和MT-Ⅲ基因cDNA的3’末端具有加尾信号从TAAA和多聚腺苷酸尾巴Poly（A）。分析表明，牦牛MT-I基因编码的MT-I蛋白由61个氨基酸组成，其中20个半胱氨酸（cys）具有保守的三肽结构：C-X-C、C-C-X-C-C、C-X-X-C等，在分子进化上十分保守；MT-Ⅲ编码的蛋白质由68个氨基酸组成，其中19个Cys除了具有与MT-I以上相同的保守短肽结构外，牦牛MT-Ⅲ蛋白质的氨基酸序列还具有T、CPCP、GEGAEA等MT-Ⅲ蛋白质特异的保守短肽结构，在分子进化上亦很保守。这些结构决定了MT-Ⅲ既具有与MT-I相同的重金属解毒等生理功能，又具有区别于MT-I的抑制神经元生长的特异功能。     

牦牛MT-I/Ⅲ基因cDNA 3′末端全长的克隆与序列分析

摘 要：分别利用基因特异引物YMT-ⅠSP、YMT-ⅢSP和M13 引物，通过RT-PCR和3′-RACE 方法从牦牛肝脏和大脑组织RNA中分别扩增并克隆出了牦牛MT-I / Ⅲ cDNA 3′ 端全长序列（分别为331bp和378bp），其中分别包含MT-I基因编码区全长（183bp）、MT-Ⅲ基因编码区全长（207bp），同时在MT-I / Ⅲ基因cDNA的3′ 末端具有加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴Poly（A）。将牦牛MT-I / Ⅲ cDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现，牦牛MT-I/Ⅲ核酸序列特别是其编码区序列在不同哺乳动物中相当保守。牦牛MT-I基因编码的MT-I蛋白由61个氨基酸组成，其中20个半胱氨酸(Cys)，具有保守的三肽结构如：C-X-C，C-C-X-C-C，C-X-X-C等，在分子进化上十分保守；MT-Ⅲ编码的蛋白质由68个氨基酸组成，其中19个Cys，除了具有与MT-Ⅰ相同的以上保守的短肽结构外，牦牛MT-Ⅲ蛋白质的氨基酸序列还具有T、CPCP、GEGAEA等MT-Ⅲ蛋白质特异的保守短肽结构结构，在分子进化上亦很保守。     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

芸薹属作物脂肪酸链延长酶基因（FAE1）拷贝数和序列变异分析

利用拟南芥脂肪酸合成途径中的脂肪酸链延长酶FAE1基因序列的保守性设计PCR简并引物,对芸薹属(Brassica)作物3个基本种和3个复合种进行了标记,并且对每个栽培种的PCR产物进行克隆和测序,进而对所获得的FAE1基因部分序列(C-端编码区序列)进行了分析。结果表明,拟南芥(Arabidopsisthaliana)和芸薹属作物基因组中具有不同拷贝数(1￣3)的FAE1基因,所测定的部分基因序列相互之间具有很高的同源性,并与其它酶基因如3-氧乙酰-乙酰载体蛋白合成酶,超长链脂肪酸合成酶和酮乙酰CoA合成酶基因具有共同的起源。     

鸡、猪BPI氨基端的基因克隆和鉴定

为了克隆杀菌/通透性增加蛋白(BP I)N端cDNA,构建重组体pM D 18-T-BP I,并进行序列鉴定,应用RT-PCR技术,参照G enB ank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PM N)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BP I)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pM D 18-T连接,构建BP I氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定;从猪PM N的总mRNA中扩增出BP I氨基端48个氨基酸的基因片段,进行测序鉴定。获得鸡BP I N端长度为285 bp的基因片段。序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心;获得猪BP IN端长度为146 bp的基因片段。成功克隆出BP I N端基因,经序列测定,确认为BP I基因,为进一步表达该基因奠定了基础。     

陕229干旱复水诱导基因表达及小麦乙烯受体(TaERS)基因特征分析

为了解小麦响应水分胁迫后复水条件下的基因表达特征,以小麦(Triticum aestivum L.)主栽品种陕229的3叶1心期幼苗为材料,采用消减杂交技术,构建了干旱复水条件下的SSH-cDNA表达文库。从消减文库中随机挑选59个插入片段大于400bp的阳性克隆测序,去除冗余序列和嵌合序列后,获得高质量EST序列32条(GenBank登录号为ES466767~ES466798)。序列比对分析表明,小麦干旱后复水的基因表达与植物对其他非生物胁迫的响应具有交叉性;17条EST序列与已知编码蛋白的基因同源性较高,涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控等方面;其他序列为新的EST。以其中一个与乙烯受体基因(ERS)同源性较高的EST序列为基础,采用同源克隆及RACE技术从小麦中分离了4个乙烯受体基因的全长cDNA序列,长度分别为2090、2271、2216和1886bp。4个全长cDNA序列所编码氨基酸序列的同源性极高(99%以上),且均具有ERS典型的GAF、HisKA和HATPase-c跨膜结构,分别命名为TaERS1(HM347272),TaERS2(HM601437),TaERS3(HM601438)和TaERS4(HQ111523)。植物ERS氨基酸序列多重比较表明,小麦与水稻的相似性最高(93%);TaERS基因的全长cDNA序列间比较共发现SNP位点23个。定量PCR表达分析显示,小麦TaERS家族基因参与了小麦植株响应水分胁迫和复水的调控机制。研究结果有助于进一步认识小麦干旱后复水的基因表达谱和小麦水分高效利用机制,探索小麦乙烯受体在水分高效利用中的作用。     

芥蓝BaCSLD的克隆、亚细胞定位及表达分析

为获知芥蓝中类纤维素合成酶基因的序列特征和表达特性,利用RT-PCR技术从芥蓝中扩增获得1个类纤维素合成酶基因全长cDNA序列,命名为BaCSLD (GenBank 登录号:MH491418),对该基因的序列特征、亚细胞定位、组织特异性表达情况进行分析,并通过最大似然法构建系统进化树。结果表明,BaCSLD cDNA序列包含一个2 796 bp的最大开放阅读框,编码931个氨基酸,且BaCSLD属于跨膜蛋白,具有8个跨膜区。BaCSLD与12个物种同源序列在进化树上分为4组,来自十字花科的AtCSLD与BaCSLD处于同一分支,亲缘关系较近的为苦瓜中的McCSLD,而与同属的油菜中的BnCSLD和芜菁中的BrCSLD关系较远。BaCSLD::GFP融合蛋白定位于细胞膜。此外,BaCSLD仅在芥蓝三级花蕾和花中表达。本研究结果为类纤维素合成酶基因功能的深入研究提供了参考。     

桃脂氧合酶(LOX)基因家族cDNA全长克隆与序列分析

根据脂氧合酶保守序列设计的简并引物从桃（瑞蟠5号）果肉总RNA中扩增出795bp的脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）基因的保守序列,并结合GeneBank中公开的LOX基因的EST序列经Blast比对分析、序列组装之后设计基因特异引物（GSP）。利用RACE技术共获得3条不同的桃LOX基因cDNA全长序列,分别命名为PpLox1-3。序列分析结果表明,这3个桃LOX基因家族成员与其他植物的LOX基因尽管在核酸水平上的差异比较大,但在蛋白水平上却有较高的同源性。通过对桃LOX基因蛋白序列和其他植物LOX进行系统进化树分析,发现PpLox1属于13-LOX类型,PpLox2-3属于9-LOX类型。     

盐地碱蓬SsDREB基因的克隆与表达分析研究

盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）是典型的盐碱地指示性植物。本研究以盐地碱蓬为材料,根据其他植物中干旱应答元件结合蛋白保守区的氨基酸序列设计简并引物,通过PCR扩增到一条长180bp的cDNA片段,继而利用RACE技术克隆了一个盐地碱蓬DREB基因全长cDNA,命名为SsDREB。SsDREBcDNA全长为14...     

番茄果实中LeERFl、LeERF2基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对番茄(Lycopersicon esculenturm)和其它植物物种中EREBP基因家族的同源性比较,在保守区(ERF区域)设计合成一对简并引物,通过RT-PCR扩增得到一个114bp的片段,用此片段作探针筛选番茄cDNA文库(粉红期),得到两个基因LeERFl和LeERF2.通过BLAST工具在GenBank中搜索表明,LeERFl和LeERF2基因属于EREBP家族,LeERFl与EREBP-4和DDTFRl0/A在氨基酸水平上的序列相似性为35%,LeERF2与EREBP-3和pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46%,是新的基因.LeERFl和LeERF2的核酸序列在GenBank发表,登录号分别为AY077626和AY275554.     

钩刺山羊草(Aegilops triuncialis)低分子量谷蛋白基因序列分析

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物,对钩刺山羊草(AegilopstriuncialisL,2n=4x=28,CCUU)PI483029总DNA进行PCR扩增,得到长度为900和1065bp的DNA片段,克隆测序后获得2个LMW-GS基因,GenBank登录号分别为AY841016和AY841017。它们具有小麦LMW-GS基因的典型结构特征。其中,AY841017具有完整编码区,长度为1065bp,可编码322个氨基酸残基的成熟蛋白,第一个半胱氨酸残基出现在重复区第13位。在重复区,AY841017的两个疏水单元为PIIIL和PVIIL,重复区中还存在一个连续13个Q(谷氨酰胺)组成的短肽。AY841016由于编码区内存在提前终止密码子,为假基因。氨基酸序列比较发现,AY841017与普通小麦(IriticumaestivumL.)Glu-D3位点编码的LMW-GS基因有很高的一致性。