稻瘟病菌对新型模式植物二穗短柄草的致病性研究

 建立了稻瘟病菌对二穗短柄草的接种体系,观察了稻瘟病菌在二穗短柄草上的发病过程和特点,并与在水稻和大麦上的发病情况进行了比较。在人为接种稻瘟病菌的条件下,二穗短柄草的叶片、叶鞘、茎秆、穗部均可获病。利用稻瘟病菌孢子悬浮液对二穗短柄草进行苗期活体或离体接种,都能引发典型病斑。与大麦相比,二穗短柄草叶片上病斑的出现时间及发展速度更接近水稻。同时,二穗短柄草叶片上的接种和发病条件比水稻更易控制,病斑更具一致性。另外,稻瘟病菌致病突变体在二穗短柄草叶片上致病性变化（降低或丧失）趋势与在水稻上的情况一致。显微观察及组织化学染色表明,稻瘟病菌在二穗短柄草叶片上可有效形成附着胞,侵入叶片表皮细胞,形成典型的侵染菌丝,其过程与水稻近似。因此,二穗短柄草可以作为稻瘟病菌与寄主互作的研究材料,并有望为杂草上梨孢菌的研究提供可能的模式植物以及为农作物的抗病育种提供参考。     

稻瘟病菌中小G蛋白Rho3的假定互作蛋白MoKin1的功能分析

小G蛋白MoRho3在稻瘟病菌生命活动中具有重要的生物学功能。前期研究表明,MoRho3的缺失对于稻瘟病菌分生孢子的形态建设、附着胞萌发和侵入能力以及对宿主的致病性等表型都存在严重缺陷。为了进一步解析MoRho3在稻瘟病菌中的网络调控途径,通过生物信息学的方法预测了MoRho3的互作蛋白。在众多假定互作蛋白中,蛋白激酶MoKin1与酿酒酵母中KIN1和KIN2是同源蛋白。在酵母细胞中,KIN1和KIN2可以抑制△rho3的表型缺陷。为了验证在稻瘟病菌中MoKin1与MoRho3之间是否存在着相似的调控途径,本研究通过分析MoKin1与同源蛋白的进化关系,序列结构,定位状态以及相关的互作蛋白,揭示了MoKin1的功能特点,为后续病原菌中MoKin1与MoRho3互作机制的研究,以及病原菌致病机制的解析提供了新的思路和方向。     

四川省稻瘟病菌群体遗传结构分析

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病是全球水稻生产上最严重的病害之一。利用6对SSR荧光标记对采自四川绵阳、营山、雅安、北川和武胜地区的5个稻瘟病菌群体的遗传结构进行分析。结果表明,在124个稻瘟病菌中检测出43个等位基因,平均每个位点的观测等位基因数为7.2,有效等位基因数为3.1,所有位点均显著偏离HardyWeinberg平衡。5个群体的平均观测杂合度(0.374)低于期望杂合度(0.502),暗示群体内存在因近交而导致的杂合子缺失。AMOVA分析显示,绝大多数遗传变异(81.17%)存在于群体内个体间,仅有18.83%的变异来自于群体间的差异。5个地理群体间呈现高水平的遗传分化(遗传分化系数为0.057~0.528)。Mantel检验表明,群体间的遗传距离与地理距离相关未达显著水平,说明稻瘟病菌的遗传变异呈现随机分布的空间模式。群体遗传学数据分析表明5个群体间存在不同程度的基因流(基因流水平为0.472~4.347),基于贝叶斯聚类法的Structure分析也证实了这一结果。     

稻瘟病抗性基因对安徽省稻瘟病菌种群抗性的影响

为分析抗稻瘟病基因对安徽省稻瘟病菌株的抗性水平的影响,采用10个水稻抗稻瘟病单基因品系对安徽不同地区的稻瘟病菌株进行致病力测定,同时对201份水稻品种的抗稻瘟病基因Pi9进行扩增,结合田间抗性表现,分析抗性基因Pi9的利用价值。抗性基因Pi9、Pik、Pizt等对安徽地区的稻瘟病菌株具有较好的抗性,抗性频率分别为66%、60%和54%,其中携带Pi9抗性基因的水稻品种的田间抗性表现也较好,说明Pi9可直接作为分子标记辅助安徽地区水稻品种选育抗原基因。     

稻瘟病菌致病性增强突变体B11的基因分析

 在农杆菌介导转化（AtMT）的稻瘟病菌突变体库中,筛选到一个菌丝生长增快,对大麦致病性增强的突变体B11。Southern杂交分析表明B11中T DNA为单拷贝插入。通过TAIL PCR克隆插入位点侧翼序列,序列测定与比对分析显示T DNA位于假想基因MG01679的编码区内。利用PCR的方法,克隆基因的DNA和cDNA序列。该基因开放阅读框包括1个内含子和2个外显子,编码序列的长度为696 bp,编码231个氨基酸的多肽,编码产物属于ThiJ/PfpⅠ蛋白家族。因此,将该基因命名为MgThiJ1。MgThiJ1蛋白序列与尖胞镰刀菌假想蛋白FOXG_09029有57%的同源性,与禾谷镰刀菌假想蛋白FGSG_08979有54%的同源性。MgThiJ1基因可能为致病过程的负调控因子,其具体作用机制有待进一步研究。     

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。     

Virulence Types of Magnaporthe oryzae to Hybrid Rice in Sichuan,China

A total of 638 isolates of rice blast(Magnaporthe oryzae) were isolated in 2002-2009 from different rice varieties in different regions of Sichuan,China and inoculated onto seven rice varieties(Lijiangxintuanheigu,IR24,Minghui 63,Duohui 1,Chenghui 448,Neihui 99-14 and RHR-1) to differentiate the virulence types of the fungus and trace the changes.The virulence to the seven varieties was respectively scored at 1,2,4,8,16,32 and 64.The total scores of individual M.grisea isolates which were the sum of scores infecting differential varieties could,in turn,be used for the nomenclature of the virulence types due to their accordance to the special virulence patterns.The 638 tested isolates were then differentiated into 56 different virulence types.Type 15 virulent to Lijiangxintuanheigu,IR24 and Minghui 63,and Type 127 virulent to all of the seven varieties were the most dominant virulence types respectively with the occurrence frequencies of 15.99% and 15.83%.Type 19 and other seven virulence types were not monitored during 2002-2009.Type 15 was the predominant virulence type in 2002,2003,2004 and 2007,whereas Type 127 had been the most dominant virulence type after 2005 except for the year 2007 when the province underwent severe drought.Five hundred and seven out of the 638 tested isolates were virulent to Minghui 63,and 89.58% of the 384 isolates virulent to either Duohui 1,Chenghui 448 or Neihui 99-14 were virulent to Minghui 63,which indicated the impact of the extensive plantation of hybrid rice Minghui 63 as the restorer line on the virulence evolution of M.oryzae in Sichuan.The virulence pattern of the dominant virulence types suggested that the acquiring of virulence to all the major resistant restorer lines was the main routes of the evolution in virulence of M.oryzae to hybrid rice in Sichuan.The virulence frequencies of the 638 tested isolates to IR24,Minghui 63,Duohui 1,Chenghui 448,Neihui 99-14 and RHR-1 were respectively 74.6%,79.5%,73.8%,37.0%,39.0% and 40.4%.The analysis for the sources of the different virulence type isolates indicated the pathogen on the newly released resistant varieties were stronger than conventional rice varieties which had become susceptible in the field since 1980s.     

稻瘟病菌一个假想几丁质酶的表达分析

为研究稻瘟病菌几丁质酶在稻瘟病菌形态建成和致病过程中的作用,对稻瘟病菌MGG_08054.6编码的一个假想几丁质酶进行生物信息学分析、基因表达及其融合蛋白分泌特性研究.结果显示:稻瘟病菌基因MGG_08054.6编码的蛋白MoChil与里氏木霉、桔绿木霉、烟曲霉、禾布氏白粉菌已知的18家族几丁质酶(EC 3.2.1.14)蛋白序列同源性大于40%,并具有几丁质酶催化区域的两个保守基序GGW和DG-D-DWE及部分几丁质结合区的活性位点,该蛋白序列经程序SignalP 3.0分析含有信号肽,在16T-17S和26Q-27S处有两个可能的剪切位点;将MGG 08054.6基因在稻瘟病菌Guy11进行过量表达,获得分泌蛋白,证明了该蛋白的分泌特性.半定量RT-PCR分析表明,该基因在不同生长发育阶段及侵染水稻阶段均有表达,其中菌丝阶段表达量最高.     

内生真菌稻镰状瓶霉对直播稻稻瘟病的防治效果

野生稻内生真菌稻镰状瓶霉在实验室条件下接种到水稻上,可以诱导水稻产生对稻瘟病的抗性。为了明确该内生菌田间不同时期施药对直播水稻稻瘟病的防治效果,2017年在浙江省桐庐县开展了田间试验。结果显示,稻镰状瓶霉不同时期施药对直播稻稻瘟病的防效与春雷霉素和芽孢杆菌相当,不同处理之间差异不显著。施用菌剂的处理对叶瘟的防效均达到70%以上;稻镰状瓶霉播后7d、14d施药处理对穗颈瘟的防效亦达70%以上。由此可见,稻镰状瓶霉可用于直播稻稻瘟病防治,拌种或播后撒施1次即可有效防治稻瘟病。     

稻瘟病菌分泌蛋白质在致病过程中的作用初探

  鉴定了稻瘟病菌孢子萌发过程中分泌产生的蛋白质。将稻瘟病菌菌株2005 50、2005 81未萌发孢子、萌发孢子以及含有孢子萌发液的萌发孢子分别接种后,病情指数分别为11.13, 35.06, 49.01和49.6, 8.4, 62.7;说明孢子萌发液中具有能够帮助稻瘟病菌侵染的物质。利用SDS PAGE电泳分析稻瘟病菌孢子萌发液,发现孢子萌发液中含有蛋白质类物质。进一步利用生物质谱鉴定和数据库资源检索,共检索到8个稻瘟病菌的蛋白质基因,其基因编号分别为MGG_01305,MGG_13188,MGG_12454等。提示这些蛋白质可能在稻瘟病菌侵染过程中具有重要的功能。     

Genetic Transformation of Rice with Pi-d2 Gene Enhances Resistance to Rice Blast Fungus Magnaporthe oryzae

The gene Pi-d2, conferring gene-for-gene resistance to the Chinese blast strain ZB15, was isolated from a rice variety (Digu) by the map-based cloning strategy. Here, we constructed a control plasmid pZH01-pi-d2tp309 (pZH01-tp309) and three different expression constructs, pCB-Pi-d25.3kb (pCB5.3kb), pCB-Pi-d26.3kb (pCB6.3kb) and pZH01-Pi-d22.72kb (pZH01-2.72kb) of Pi-d2, driven by Pi-d2 gene's own promoter or CaMV35S promoter. These constructs were separately introduced into japonica rice varieties Lijiangxintuanhegu, Taipei 309, Nipponbare and Zhonghua 9 through Agrobacterium- mediated transformation. A total of 150 transgenic rice plants were obtained from the regenerated calli selected on hygromycin. PCR, RT-PCR and Southern-blotting assay showed that the gene of interest had been integrated into rice genome and stably inherited. Thirty-five transgenic lines independently derived from T1 progeny were inoculated with the rice blast strain ZB15. Transformants exhibited resistance to rice blast at various levels. The lesions on the transgenic plant leaves were less severe than those on the controls and the resistance level of transgenic plants harboring the gene of interest from three vectors had no difference. The own promoter of Pi-d2, about 2.2 kb or 3.2 kb, had the similar promoter function as CaMV35S. Field evaluation for three successive years supported the results of artificial trial, and some lines with high resistance to rice leaf blast and neck blast were obtained.     

稻瘟病菌无毒基因Avr-Pid2的分子标记及其连锁图

无毒基因的克隆与变异监测可以为水稻抗病品种布局与利用提供重要信息。将菌株GUY11和FJ81278及其有性后代接种水稻品种Pi-d2及其亲本TP309进行毒性分析。结果表明,FJ81278含Avr-Pid2,有性后代在Pi-d2上的无毒、有毒分离比例符合1:1,推断FJ81278对Pi-d2的无毒性由单一基因座控制。通过SSR标记和转座子元件标记分析,确定Avr-Pid2定位于染色体7上,并获得了与无毒基因Avr-Pid2连锁的标记Propiz-t和ms7-27/28,它们与Avr-Pid2的遗传距离分别为6.1 cM、13.0 cM。这些标记的获得将Avr-Pid2限制在第7染色体上约420 kb物理距离范围内,为进一步的克隆奠定了良好基础。     

稻瘟病菌大片段DNA转化载体的构建

构建能够转化大片段DNA的载体是进行基因簇功能分析的重要手段。利用cosmid载体和pBHt2载体构建了一个可以在稻瘟病菌中转化大片段DNA的载体,通过农杆菌介导的转化方法,成功地将超过30kb的大片段DNA转化到稻瘟病菌中。研究结果将促进稻瘟病菌基因簇的功能分析。     

稻瘟病菌基因组中微卫星序列的频率和分布

 利用已经公布的稻瘟病菌基因组测序结果，对该植物病原真菌基因组中的微卫星（SSR）的类型、大小及分布进行了系统分析。在已经公布的37.89 Mb的基因组序列中，共有16 398个由1~6个核苷酸为基序的SSR序列（匹配值为80％），其总长度占整个基因组碱基数的0.87％，平均2.31 kb碱基中就分布有1个大于15 bp的SSR。其中数量最多的是单碱基重复，达到4 392个，其次为三碱基重复序列 （3 586个），五碱基重复序列（3 442个），这3种SSR总数达11 420个，占SSR的 69.7%。数量最少的是二碱基重复序列，只有680个。在整个基因组中的主要基序有A，AG，AC，ACG，AGC，AAG，GGC，ACCT，ATCC，AAAG，AAAAG，AAAAT，AAAAC，AAAAAG， AAAAAT和AACTAG。有的基序类型则完全没有出现。对不同超级连锁群的分析结果表明，各连锁群之间的SSR分布有一定差异，但总体上仍是较为均衡的。这些结果为稻瘟病菌的基因标记、群体结构研究、非编码区DNA序列的结构及功能研究提供了一个较好的基础。     

稻瘟病菌不同拼接版本基因组序列差异性比较

为了明确稻瘟病菌不同拼接版本基因组序列的差异,促进合理利用不同拼接版本基因组序列,比较了不同版本稻瘟病菌基因组数据库微卫星序列的分布情况,功能基因的位置及长度差异,SSR引物的位置差异等。结果表明,不同基因组数据库在序列长度上差异明显,功能基因的位置、SSR引物位置和SSR核苷酸重复类型数量也差异明显。无毒基因Avr-Pizt连锁标记比较分析表明Avr-Pizt基因定位在不同数据库中差别明显。不同稻瘟病菌数据库中,第7染色体的序列与其上的BAC序列之间差异显著,虽然这不影响功能基因的分析,但影响无毒基因图位克隆的定位区间的判断。因此,稻瘟病菌研究者应根据实际情况选择相应的数据库。     

稻瘟病菌阅读框架中SSR频率、分布及所在基因功能

 在对稻瘟病菌基因组中SSR分布进行了系统分析的基础上，对由1～6个碱基为重复单元的SSR在基因的蛋白质编码区中的分布进行了分析。结果表明，该病原菌的2 378个基因的编码区中共分布有3 240个SSR序列（标准是15 bp以上，匹配值为80％）。在已经有注释的4 732个基因中，861个基因的编码区中有SSR。编码区中的SSR以三碱基重复和六碱基重复为主，其他类型的SSR则很少在编码区中出现。SSR在这些基因中很少有保守性，表明这些基因的高度变异，或者起源是较晚的。含有SSR的基因多为转录蛋白、信号传导的细胞调节基因这一现象表明，SSR在物种形成过程中有重要作用。利用基因编码区中丰富的SSR序列信息及其变化带来的功能变化的信息，将可以在该菌功能基因组的研究中发挥十分重要的作用。     

禾本科新型模式植物二穗短柄草的研究进展

二穗短柄草 (Brachypodium distachyum) 植株矮小,生育期短,基因组大小仅为水稻的0.71倍;和水稻相比,在进化上它与小麦等温季型禾谷类作物的亲缘关系更近,是目前较为理想的禾谷类作物模式植物.在短短几年中人们对这一模式植物在细胞遗传学、基因组学以及遗传转化等方面进行了大量研究.对已取得的研究进展进行了全面总结和综述,以期为禾谷类作物尤其是温季型禾谷类作物的相关研究提供参考.     

稻瘟病菌类LxAR家族基因的预测及表达分析

在侵染水稻过程中,稻瘟病菌分泌一系列效应因子来抑制寄主免疫系统。无毒效应因子AVR Pii和AvrPiz-t的氨基酸序列含有类LxAR基序,基于此,本研究利用生物信息学技术,从稻瘟病菌基因组中筛选获得了99个含有类LxAR基序的假定效应因子(MoLLEs)。该家族蛋白都为小分子蛋白(70~300 aa),富含半胱氨酸氨基,绝大多数为未知功能的蛋白。24个蛋白含已知的功能域,可能涉及了多种生命过程,其中有9个蛋白编码植物细胞壁降解酶。通过表达模式分析发现,MoLLEs家族基因成员的表达受到饥饿胁迫、附着胞生长发育以及侵染水稻等过程的诱导,此外一部分基因受到附着胞发育关键基因PMK1调控。基因表达交叉分析表明,部分基因同时在附着胞发育和致病过程中上调表达。在与水稻的相互作用中,MoLLEs在稻瘟病菌侵染不同阶段均有上调表达,并且部分基因受亲和或非亲和反应特异性诱导。      

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

基于无毒基因序列的稻瘟病菌指纹类型与致病型的关系初探

基于已克隆的稻瘟病菌无毒基因序列和基因组序列,设计了4对特异性引物,对不同来源的31个菌株进行PCR扩增,得到13个指纹类型。同时将31个菌株在7个中国鉴别品种、7个以丽江新团黑谷为背景的近等基因系鉴别品种和12个日本单基因鉴别品种上接种鉴定其致病型,分析菌株指纹类型与致病型之间的关系。结果表明,病菌的指纹类型与基于日本单基因鉴别品种划分的致病型间存在一定程度的对应关系。