重庆地区山羊痘病毒分离鉴定及其动物模型构建

该研究旨在对重庆地区一疑似山羊痘病病例进行病原分离鉴定,并构建动物模型,分析其致病性。利用临床诊断与实验室诊断技术,对山羊痘进行鉴定,并利用BHK21细胞对山羊痘病毒进行分离纯化,将纯化到的毒株人工感染3月龄羔羊,构建动物模型,分析羔羊发病情况。分子鉴定结果表明:PCR扩增出了山羊痘病毒P32基因特异性条带,经测序共815 bp,该序列在NCBI中经BLAST比对与山羊痘病毒(NCBI登录号:AY880717.1)的同源性最高(99%),且在系统进化发育树中也与其聚为一簇;细胞培养结果表明,在接种72 h后,细胞出现变圆、聚集和脱落的现象;攻毒结果显示,实验组羊只体温升高(42℃),第7天在唇部和尾根部出现红色丘疹和水泡,第15天唇部出现褐色结痂。该研究为山羊痘的防治和致病机理研究奠定了基础,也为山羊痘地方株疫苗研究提供了理论依据。     

山羊痘病毒贵州株的分离与鉴定

山羊痘是由羊痘病毒属山羊痘病毒(GPV)引起的一种严重危害山羊的高度接触性传染病.试验通过病原分离、琼脂扩散试验、鸡胚接种、电镜形态学观察及PCR鉴定等方法对贵州地区山羊群爆发的疑似山羊痘进行病原的分离与鉴定,现报道如下.     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

山羊痘病毒检测方法研究进展

就山羊痘病毒分离鉴定、电镜观察、ELISA试验、琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、PCR试验等检测方法进行了综述,以期为山羊痘病毒的实验室诊断提供参考。     

山羊痘病毒的分离与鉴定

对贵州省2002年以来发生的疑似山羊痘病例样品进行了病毒的分离与鉴定。取山羊痘病羊的皮肤痘疹和水疱作待检病料,接种BHK-21传代细胞盲传3代后,出现了明显的、规律的细胞病变(CPE),病毒细胞培养物在F4代以后,能与山羊痘标准阳性血清在琼脂扩散试验中出现白色沉淀线,而与正常细胞的培养物及PBS不出现沉淀线;参照GenBank上山羊痘病毒P32基因序列,设计了1对特异性引物,对现场分离毒株进行PCR扩增,可扩增出963bp特异性的DNA条带。用待检病料感染的BHK-21细胞培养物接种9日龄鸡胚绒毛尿囊膜,随着传代次数的增加,痘斑病变的出现率从13.3%～20%上升至33.3%～40%;用山羊痘病变皮肤、鸡胚绒毛尿囊膜和感染细胞进行超薄切片,在电子显微镜下可以观察到典型的山羊痘病毒粒子。     

携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

山羊痘病毒NM株的分离鉴定

从内蒙古牛场疑似山羊痘病毒感染的病羊中分离到1株病毒,命名为NM株。取病羊的皮肤痘疹和水疱作病料样品,分别接种BHK-21传代细胞和10日龄SPF鸡胚。结果表明,BHK-21细胞出现了明显的、规律的细胞病变,鸡胚接种部位出现了明显的痘斑;NM株细胞毒和胚毒均能够被山羊痘病毒阳性血清所抑制。利用1对山羊痘病毒特异性检测引物对NM株病毒进行PCR扩增,获得445 bp片段,与预期大小一致。将扩增产物提纯后克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定正确后,对阳性克隆株进行序列测定,结果表明,NM株的基因片段与已发表的山羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.2%~100%之间。     

山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析

山羊痘是由山羊痘病毒(goat pox virus,GTPV)引起的一种急性、热性、接触性传染病,A27L蛋白是山羊痘病毒细胞内成熟病毒粒子重要的免疫保护抗原之一,为检测该蛋白诱导的特异性免疫应答,笔者等开展了山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析。结果表明:山羊痘毒株(GTPV-S-1)的ORF112基因序列与不同来源的山羊痘病毒分离株相比较,ORF112基因核苷酸序列的同源性达86.8%以上,说明山羊痘病毒的ORF112基因具有高度保守性。该结果为建立敏感、快速、准确、简单易行的GTPV检测方法和ORF112蛋白的后续研究奠定了基础。     

山羊痘病毒贵州分离株P32基因的克隆及序列分析

山羊痘(goat pox)是由羊痘病毒属(capripox-virus)山羊痘病毒(goat poxvirus,GPV)引起的一种主要危害山羊的高度接触性传染病[1]。本试验应用PCR技术,从山羊痘病毒DNA中扩增P32基因,通过pMD18-T克隆载体转化到DH5α工程菌中,并进行重组质粒的鉴定,旨在探索山羊痘病毒贵州株与国     

布鲁菌OMP25基因重组山羊痘病毒的构建

将羊种布鲁菌外膜蛋白25(OMP25)基因插入到山羊痘病毒转移载体PGM-TK-I1L-GPT1启动子I1L的下游,构建重组山羊痘病毒转移载体。用脂质体转染法将重组转移载体与山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55共转染绵羊成纤维细胞,在细胞内同源重组。通过霉酚酸药物筛选、纯化,经PCR鉴定获得了重组山羊痘病毒。     

山羊痘云南流行毒株的分离鉴定及P32基因PCR-RFLP分析

应用牛睾丸细胞,从12份采集自云南省不同疫点的山羊痘病羊肺脏中分离获得3株可疑毒株.这3株流行毒株经本动物回归试验、PCR鉴定及P32基因PCR-RFLP分析后确诊为山羊痘病毒,并据分离地被命名为MYS、XW、XD毒株.     

山羊痘病毒PCR/酶切检测方法的建立

为了建立一种快速的山羊痘检测方法,根据山羊痘病毒基因组保守区T3A/T3C基因设计了1对引物,以山羊痘病毒DNA为模板进行PCR扩增并连接到pMD18-T载体进行序列测定,测序结果显示片段长491 bp,与已报道的山羊痘病毒对应序列进行比对,同源性高达98%。特异性和灵敏性试验及PCR产物的酶切位点分析表明,该引物特异性好,敏感性强。本研究建立的山羊痘病毒PCR/酶切检测方法可应用于山羊痘病毒感染的临床诊断。     

山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

山羊痘病毒粒子的电子显微镜观察

本研究室2003年以来对山羊痘病毒感染多种细胞进行了透射电镜观察。在感染的皮肤和黏膜上皮细胞浆中观察到大量不同成熟阶段的典型山羊痘病毒粒子，病毒粒子也见于巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞胞浆内，甚至少量散在血管腔中。用山羊痘病毒分离物感染鸡胚绒毛尿囊膜形成痘斑，其上皮细胞和成纤维细胞中也可见成熟和不成熟的病毒粒子，同时感染BHK-21细胞也观察到典型的山羊痘病毒粒子。     

山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性

以贵州本地分离纯化的山羊痘病毒为试验材料,感染Vero细胞,通过台盼蓝、吖啶橙/溴乙锭荧光染色分析细胞的死亡及凋亡比例;经特异性PCR从山羊痘病毒基因组中分离出山羊痘病毒抗凋亡蛋白样基因,基因长531bp,含有完整的编码框,与绵羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的相似性为97%,因此确定为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。进一步研究山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因在Vero细胞中的表达,结果显示,病毒感染Vero细胞24h时没有检测到凋亡现象,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的mRNA水平最高;感染48h时,Vero细胞的凋亡率上升到13%,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量随之下降。结果表明,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量与Vero细胞的凋亡呈负相关,有助于病毒在细胞内的生存和侵染等过程。     

绵羊痘病毒P32基因克隆与进化分析

利用PCR技术扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,并进行同源性比对及进化分析.结果表明,该病毒与其他绵羊痘病毒与山羊痘病毒同源性分别为99％与96％.     

表达小反刍兽疫病毒F蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定.免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRV F蛋白.以2×106PFU的rGPV-PPRV-F皮内注射免疫山羊3只,并于首次免疫后第28 d以相同剂量进行二次免疫.分别于一免后21 d和二免后14 d采血后分离血清进行病毒中和试验.结果表明,一免后21 d山羊痘病毒(GPV)中和抗体效价依次为1:40、≥1:80、≥1:80,PPRV中和抗体效价依次别为1:20、1:40、1:20,全部阳转;二免后14 d,GPV中和抗体效价≥1:80,PPRV中和抗体效价依次为1:20、1:80、1:40.本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础.     

奶山羊羔羊山羊痘的病理学、血清学及分子生物学诊断

目的 确定内蒙古某规模化奶山羊养殖场部分引进羔羊发病死亡的原因,为该场加强重点疫病免疫防控提供科学依据。方法 对出现典型临床症状的发病羊只进行病理解剖学观察,无菌采集肺脏病变样本,制备病理组织切片;无菌采集发病羊只的血液制备血清,采用高敏荧光技术检测血清中的山羊痘病毒抗体;无菌采集发病羊只的肺组织、鼻拭子、眼拭子,利用PCR技术检测山羊痘病毒P32基因,对测序获得的序列进行BLAST比对并进行同源性分析。结果 剖检可见病羊口腔、鼻腔、喉头、气管黏膜有圆形疹痘;肺部明显水肿,表面存在红色疹痘,切开后呈不透明、灰白色胶冻样;瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃黏膜均出现疹痘。病理组织学检查可见肺泡红色深染,间质变宽,腔内存在脱落的上皮细胞,Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,并化生为腺泡样状;支气管腔内存在大量的炎性细胞。发病山羊血清经高敏荧光技术检测,判定为山羊痘病毒抗体阳性。采集肺组织（GTPV-YP1）、鼻拭子（GTPV-YP2）、眼拭子（GTPV-YP3）样品各1份,3份样品经P32基因PCR检测均获得983 bp的扩增片段,与预期大小一致;GTPV-YP1、GTPV-YP2样品P32基因序列与山羊痘病毒中国分离株KC951854.1、Oman分离株 MN072621.1 P32基因的同源性为100%,GTPV-YP3与山羊痘病毒中国分离株EF514892.1、HM572329.1、JN596275.1、MG817382.1的同源性为99.0%。结论 经病理解剖学观察、病理组织学检查、血清学检测以及病原PCR鉴定,确定引起该场引进奶山羊羔羊发病的原因为山羊痘病毒感染。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析

对山羊痘病毒贵州分离株（LD株和QL株）和参考株（Y株和B株）,采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以3种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48h～60h后,Vero细胞呈现典型的细胞病变;病毒基因组提取样本的纯度在1．8～1．9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,比参考弱毒株B株少3条～4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。