鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

肌抑素Myostatin突变体Pro区域的克隆、表达和活性

为了检测肌抑素Myostatin突变体的Pro区域生化活性，设计引物从肌抑素突变的双肌牛皮尔蒙特(Piedmontese)的基因组中扩增得到肌抑素突变体的Pro区域，并分别将其亚克隆到pMD18-T载体上。利用基因重组技术，构建原核表达质粒。pET30a( )／Myostatin-Pro(简称pEMPro)，在大肠杆菌(Eschetichia coli)中分泌表达肌抑素突变体Pro区域，采用亲和层析法纯化表达产物，并将其共孵育于体外培养的绵羊的骨骼肌细胞。证实肌抑素的突变体Pro区蛋白具有促进肌肉细胞增殖的功能。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

番茄Metacaspase基因(LeM)的克隆及其在大肠杆菌Rosetta中的高效表达

为获得可溶性的番茄Metacaspase蛋白,后续研究Metacaspase蛋白的酶学特性以及功能,利用RT-PCR方法克隆了番茄(Lycopersicon esculentum)中Metacaspase(LeM)全长cDNA,并成功地构建了LeM基因的原核表达载体重组质粒pET28a-LeM,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS和Rosetta中进行诱导表达,并对诱导表达条件进行了优化.SDS-PAGE结果显示,在37℃条件下,1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,在BL21(DE3)PlysS菌株中重组蛋白主要以包涵体形式存在,而相同条件下在Rosetta菌株中多为可溶性表达.同时酶活测定显示,Rosetta上清中LeM的活性为33 RFU/min,显著高于BL21(DE3)PlysS 7RFU/min.本实验表明,不同菌株对Metacaspase的可溶性表达有很大影响.     

水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因（ASP）,并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因（ZEN-jjm）的克隆、表达及活性分析

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是世界上污染范围最广泛的一种镰刀霉毒素,能导致人或动物不孕、流产等症状,损害内脏器官并促进癌细胞的生长.本文通过设计1对特异性引物,从粉红螺旋聚孢霉(Gliocladium roseum)中克隆获得大小为795 bp的DNA片段(ZEN-jjm),通过构建E. coil原核表达载体进行表达.经HPLC检测证实,IPTG诱导后的细胞裂解上清能在3 h内完全降解液体中1μg/mL的ZEN.序列分析结果表明ZEN-jjm与zhd101存在9个碱基的差异,ZEN-jjm编码的ZEN降解酶与文献报道的乳糖水解酶存在3个氨基酸的差异,但ZEN毒素降解实验证实二者活性相似.     

高粱抗病基因SbSGT1的克隆及原核表达

为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L^-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。     

人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化

鸢尾素(Irisin)是新发现的一种肌肉因子,其前体是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDCS).为实现人(Homo sapiens) Irisin的原核表达,通过反转录PCR得到人肌肉组织总RNA的cDNA,并以特异性引物扩增得到人FNDC5基因的cDNA序列.以特异性引物扩增将人Irisin基因序列引入NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,经双酶切后插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒并转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) pLysS.通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测,用镍柱纯化目的蛋白,并用Western blot方法鉴定.DNA序列分析结果显示,克隆的人Irisin基因序列和NCBI公布的序列一致,并成功构建了pET-30a-Irisin重组表达载体;SDS-PAGE电泳检测和Western blot结果表明,表达蛋白分子量约为14kD,与预期大小一致;实现了人Irisin的可溶性表达,得到了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究人Irisin蛋白的结构、功能及应用提供了理论依据.     

毛竹PheDof2转录因子克隆及表达分析

Dof蛋白是单锌指结构蛋白家族之一,在植物生长发育和非生物胁迫中发挥重要作用.为了探索Dof转录因子在毛竹中的功能及表达特征,本研究以毛竹实生苗为材料,采取反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到PheDof2基因的cDNA序列,对其进行生物信息学初步分析,并检测其在毛竹不同高度笋、花发育,及不同胁迫处理下的表达情况....     

阴沟肠杆菌UW4菌株ACC脱氨酶基因的克隆、序列分析及原核表达

从阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)UW4菌株提取细菌总DNA,根据已报道的阴沟肠杆菌ACC脱氨酶(1-aminocy-clopropane-1-carboxylicaciddeaminase)基因序列设计简并引物,通过PCR扩增获得1条约1.02kb特异片段,把该片段连接到pGEM-Tvector上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长为1017bp,共编码338个氨基酸残基,与报道的序列相比仅存在8个核苷酸的差异,同源性达99.1%;将其翻译成氨基酸序列后发现,仅引起了4个氨基酸残基的变化,氨基酸同源性为98.2%。利用DNASIS软件对蛋白质二级结构进行分析比较,发现其蛋白质二级结构及其单元与报道的序列完全一致。将其插入原核表达载体pET-28b进行诱导表达,发现其表达蛋白在分子量约39kD处比对照多出一明显条带;经Westernblot分析检测,发现此带即为His-ACDS融合蛋白。     

丹参海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SmTPS）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,得到一条海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）基因,将其命名为SmTPS,GenBank注册号为JF937196。该基因cDNA全长2836 bp,包含一个长为2574 bp的ORF,编码857个氨基酸。生物信息学分析表明,分子量为97.04 kD,等电点为5.76,含α-螺旋、β转角、延伸连和无规则卷曲。该蛋白同时具有海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（TPP）的功能结构域。系统进化树分析表明丹参TPS功能域和拟南芥AtTPS6属于一类,而TPP功能域与低等生物酵母ScTPS2属于一类。实时定量PCR结果分析表明,SmTPS基因在丹参不同组织器官中差异表达,其茎中表达量最高。在干旱和低温处理下,其表达量与对照相比均可上调约2倍,表明SmTPS基因在丹参抵抗干旱和低温胁迫中发挥一定的作用。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

加州鲈卵泡抑素cDNA的克隆、分析和原核表达

卵泡抑素是TGF-β超家族中一些成员的抑制蛋白，具有促肌肉生长的作用。采用RT-PCR和RACE技术从加州鲈成鱼卵巢总RNA中扩增得到卵泡抑素cDNA，序列分析结果表明，加州鲈卵泡抑素cDNA全长1444bp，包括开放阅读框966bp，5¢非编码区82bp，3¢非编码区359bp。该基因编码321个氨基酸，其中信号肽31个氨基酸，成熟肽290个氨基酸，成熟蛋白由四个功能区组成，分别为：N-domain、Domain Ⅰ、Domain Ⅱ和Domain Ⅲ，其中N-domain具有与TGF-β超家族中一些成员特异性结合的结构，可抑制这些蛋白发挥作用。将加州鲈卵泡抑素氨基酸序列与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑和斑点叉尾鮰比较，同源性分别为97％、89％、88％、88％和70％，其中N-domain氨基酸序列的保守性更高一些，与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑、斑点叉尾鮰、非洲爪蟾、人、猪、大鼠、鸡的相比较，同源性为75%～100％。为获得重组卵泡抑素蛋白，将成熟肽cDNA插入表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测，结果检测到一分子量约52kD的特异蛋白带，与预期大小一致，Western blot检测到表达产物表明成功获得了卵泡抑素的融合蛋白。加州鲈卵泡抑素cDNA序列和重组蛋白的获得为进一步研究鱼类卵泡抑素的促肌肉生长奠定了基础。     

玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶同功酶生物信息学分析、基因克隆和原核表达

尿卟啉原Ⅲ脱羧酶是生物卟啉类化合物分支合成的关键酶。从GenBank中搜寻到4种玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶：Les22、UROD1、UROD2和截短UROD,氨基酸序列比对显示N端的同源性较差;玉米les22基因比urod1基因在开放阅读框的上游少3个碱基,导致阅读框移码。植物除玉米外存在高度同源的UROD1和UROD2,具有结构完整性。本文以玉米幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR克隆了玉米les22和urod2基因,并对突变位点进行校正,同时通过定点突变获得urod1基因,它们都编码去除叶绿体导肽的尿卟啉原Ⅲ脱羧酶。再分别将les22、urod2和urod1基因插入大肠杆菌的不同表达载体,转化表达菌株BL21（DE3）,16℃诱导表达18h,SDS-PAGE分析显示,Les22的N端含有组氨酸标签或SUMO蛋白,重组蛋白表达为包涵体,UROD2的N端含有组氨酸标签或SUMO、TRX、GST或MBP蛋白,未检测到目的蛋白在上清液的特异表达,而UROD1和MBP融合为可溶性表达,表明玉米UROD的N端氨基酸残基可能参与蛋白在大肠杆菌的折叠。这为研究玉米UROD的种类和功能奠定基础。     

籽粒苋（Amaranthus cruentus L.）核糖体蛋白S25基因（cDNA）的克隆及其表达分析

Ribosomes, the agents of protein synthesis, consist of roughly equal amounts of RNA (rRNA) and protein (r-protein). Knowledge of the ribosome and its function mainly comes from the extensive work on 70S bacterial ribosomes. There are 21 proteins in the small (30S) subunit and 30 in the large (50S) subunit in E. coil ri bosomes. The 80S eukaryotic ribosomes are more com plex than the bacterial ones and contain at least 30 pro teins in the small (40S) subunit and 40 in the large (60 S) subunit. These r-proteins are named S1 to S30 and L1 to L40 according to whether they arise from the small or large subunit, and to their mobility in gels. In plants, several ribosomal protein genes and/or cDNAs have been isolated, such as the small subunit proteins S 11, S13, S14, S16, and S19 and the large subunit proteins L2, L7, L17, and L27. Here we report the r-protein S25 cDNA, Arps25, from Amaranthus cruentus L.