鸡MxA全基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。本文以Poly:IC和干扰素联合诱导鸡成纤维细胞，使MxA基因活化并转录mRNA，然后从细胞中提取总RNA，并进行RT-PCR，扩增MxA基因，序列分析后克隆到pGEX原核表达载体中，在大肠杆菌中进行诱导表达。表达产物经复性、纯化回收后，得到浓度为10mg/ml较纯的MxA重组蛋白。经体内、体外活性检测实验表明，此表达产物具有阻断新城疫病毒感染的功能,具有很好的研发前景。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达

通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。     

水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达与活性检测

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,亚克隆到pET30a中构建原核表达载体pET30a-LI,并转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。其重组菌株在37℃条件下,经1.0mmol/L IPTG诱导表达重组LI蛋白,该蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的39.2%。采用Ni2 -NTA柱上复性法获得有活性的纯化重组亚油酸异构酶,其比活力5.12U/mg,是天然亚油酸异构酶比活力的2.5倍。     

猪干扰素γcDNA的分子克隆与在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR技术从猪脾淋巴细胞总RNA中扩增出猪干扰素γcDNA(SwIFN-γ2).SwIFN-γ2与已报道的猪干扰素γ序列基本一致,仅在462位核苷酸处发生了点变异.在SwIFN-γ2成熟蛋白基因两端分别合成含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到pQE30表达载体,转化宿主菌SG13009(pREP4),经IPTG诱导表达了N'端含6个组氨酸的重组猪干扰素γ(6His-rSwIFNγ2).重组干扰素的表达量占总菌体蛋白的33.5%.采用Ni-NTA金属螯合亲和层析纯化6His-rSwIFNγ2,其纯度达90%以上,经8 mol/L尿素溶液变性、透析复性后,其抗滤泡性口炎病毒比活性为8×103～1.6×104U/mg.     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

麻鸭白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性

根据GenBank发表的鸭IL-18 cDNA基因序列，设计、合成一对引物，直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增麻鸭IL-18成熟蛋白基因，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了麻鸭IL-18成熟蛋白基因全序列，其大小为513 bp，编码一条由170个氨基酸残基组成的多肽。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pQE30，构建重组表达质粒pQE30-mDuIL18，转化大肠杆菌M15，并用IPTG 诱导。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19.76 Ku的重组蛋白，Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在，包涵体经变性、复性处理后进行鸭T淋巴细胞转化试验表明，重组蛋白具有明显促进鸭T细胞转化的生物学活性。用mDuIL-18（150 ng or 200 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫鸭2周后，HI抗体平均滴度达到7.5–7.7 log 2 ，而只用AIV 疫苗免疫和用mDuIL-18（100 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3–6.6 log 2，表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。这为研究鸭IL-18结构和生物学应用，以及研制新型免疫佐剂和免疫调节剂奠定基础。     

鸡HNF1α在大肠杆菌中的表达及其纯化

肝细胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)调控众多的肝脏特异性基因,参与机体的脂类、糖类和蛋白质的代谢过程。以PCR技术从本研究室已构建的真核表达载体pc DNA3.1-HNF1α质粒上扩增获得鸡(Gallus gallus)HNF1α的编码序列,在其5′、3′端分别引入的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,以此位点将其克隆入p ET30a表达载体,并构建获得重组表达菌BL21-p ET30a-HNF1α。然后以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)(0.1~0.8 mmol/L)优化重组蛋白的诱导表达,并采用15℃的低温诱导重组蛋白的可溶性表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot分析结果显示,与未诱导组相比,重组表达菌在37℃下,经不同浓度的IPTG诱导4 h后均能产生一条约69 k D的蛋白条带,与预计目的蛋白HNF1α的大小相一致,且IPTG浓度在0.1 mmol/L时诱导重组蛋白的量高于其他浓度组,而低温诱导未能使重组蛋白可溶性表达。于是采用8 mol/L尿素变性包涵体,溶解重组蛋白,通过融合在HNF1α重组蛋白C端的6-His多肽,以Ni2+对重组蛋白进行亲和层析纯化,结合固—液两相法对目的蛋白进行原位复性。结果显示通过Ni2+亲和层析和目的蛋白原位复性相结合的一步纯化法,成功地从包涵体中获得了纯度高达95%以上的重组蛋白HNF1α,这为研究鸡HNF1α在糖脂代谢、机体生长及抗体的制备等方面提供了物质保障。     

牛γ-干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达及抗病毒活性比较**

用RT-PCR从经ConA刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增了BolFN-γ基因，克隆人pGEM T-easy载体测序。再亚克隆其成熟肽基因，分别构建大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET28a／BolFN-γ和毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZα／BolFN-γ前者存Ecoli BL21中经IPTG诱导实现了高效表达，表达蛋白占菌体总蛋白的30％，表达产物以包涵体形式存；后者存P. pastorisGS115中经甲醇诱导实现了高效分泌表达，表达产物直接分泌到培养上清中，表达量约为1．0g／L。分别在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上对2种表达蛋白的抗病毒活性进行了比较，结果表明，两种重组蛋白在MDBK／VSV抗病毒活性高于在CEF／VSV上的活性，而毕赤酵母表达的蛋白抗病毒活性高于大肠杆表达蛋白，约为前者的2倍。     

牛干扰素-tau基因的原核表达及生物功能鉴定

本试验采用PCR方法直接从牛早期胚胎细胞液中扩增牛干扰素-tau （bIFN-τ）基因（含信号肽基因序列）,并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆,将含信号肽和不含信号肽的bIFN-τ 片断分别克隆到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,进行IPTG诱导表达,表达产物进行变性、复性和纯化,最后通过抗病毒活性检测和对体外培养的牛子宫内膜上皮细胞形态变化的影响,鉴定其生物学功能。结果表明,不提取胚胎基因组DNA,以胚胎的裂解液为模板,可以从少量（5枚）牛囊胚中直接扩增得到bIFN-τ基因,与Genbank报道的序列相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别达99％和97％;SDS-PAGE电泳检测,不含信号肽的bIFN-τ基因与表达载体形成的重组质粒,在约20kD处出现特异性条带,与目标蛋白分子量一致;病毒抑制法测定rbIFN-τ的抗病毒活性单位为1×104IU/mg,在牛子宫内膜上皮细胞培养液中添加rbIFN-τ作用24 h后,细胞体积增大,细胞内出现明显的囊泡状结构,表明本研究获得的rbIFN-τ具有一定的生物活性。     

鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备*

将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。     

牛IL-18融合蛋白的原核表达及生物学活性测定

将牛白细胞介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)获得重组菌株。该重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳表明,BoIL-18融合蛋白获得了高效表达,分子量约为44kD,凝胶薄层扫描分析显示,融合蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;用亲和层析法对表达产物进行纯化,检测纯化产物的生物学活性。对外周血单核细胞(PBMC)的增殖实验证明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对PBMC有明显的增殖作用;对IFN-γ的诱生实验显示,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20mg/L时,能促进IFN-γ的产生,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强。     

猪源抗菌肽Protegrin-1基因在大肠杆菌中的融合表达

为了使猪源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)在原核表达载体中获得高效表达,在不改变PG-1氨基酸的基础上,根据大肠杆菌偏好密码子表,替换PG-1部分密码子,设计两段互补的引物,利用搭桥PCR技术扩增完整的PG-1成熟肽基因,重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成抗菌肽PG-1基因融合表达载体pGEX4T-PG-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)plyS中,筛选得到阳性克隆,并用1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE电泳图谱显示在28 kD处有特异性的蛋白条带出现,经Western blot检测表明重组子已经成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白.纯化得到的GST-PG-1用凝血酶切割后,经用亲合层析得到分子量约为2 kD抗菌肽PG-1蛋白1.38 mg/L.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽PG-1具有明显的抑菌效果.     

鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。     

牛病毒性腹泻病毒E2结构蛋白的原核表达、纯化及鉴定

根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2基因设计1对特异性引物,以Oregon CV24株为模板,PCR扩增目的片断后与pET-32a原核表达载体连接,转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果表明重组E2蛋白在体外得到较好表达,表达的融合蛋白分子量为57.7 ku。可溶性分析表明重组E2蛋白以包涵体的形式存在,经镍柱His标签蛋白纯化后进行western-blot检测。结果表明：E2重组蛋白均具有反应原性,能与BVDV的阳性血清进行反应。     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。     

Ⅰ群禽腺病毒33K基因的原核表达与鉴定

33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ）的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。     

猪链球菌2型纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白 全基因的克隆及融合表达

采用发表的引物对,以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白基因fbps（GenBank登录号为AY565303）克隆于pMD-T18载体构建成载体pMD-T-fbps.经内切酶酶切和测序鉴定后,将由pMD-T-fbps内切酶切下的片段定向克隆于表达载体pET-32a（＋）,得到重组质粒pfbps.将重组质粒pfbps转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21株,经IPTG诱导,可高水平地表达相对分子量为83 kD的融合蛋白.配体印迹结合试验表明,表达的融合蛋白可与人纤连蛋白结合.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在大肠杆菌中的表达及其生物活性的初步鉴定

摘要：利用基因重组技术将鸡传染性支气管炎病毒S1基因分段（A段和B段）克隆到pGEX-6p-1载体中，并利用IPTG诱导表达。表达产物裂解后，经SDS-PAGE电泳和考马司亮蓝染色，有明显的融合表达蛋白条带。通过特异性抗体的Western-blot检测，两段表达产物均在相应位置出现了明显的条带，证明表达产物具有部分抗原性。用Glutathione Sepharose 4B纯化出GST融合蛋白。将纯化得到的融合蛋白免疫家兔，连续免疫3次，将得到的抗体与200TOCID50/0.1ml病毒工作液在37℃温育1h进行气管环试验，计算结果 A段抗体的50%血清中和终点为1：18，而B段抗体的50%血清中和终点为1：53，从而表明这两段的表达产物具有较好的免疫原性，且B段表达产物的免疫原性比A段高。