口蹄疫病毒特异性抗体间接ELISA检测方法的建立

以Chap10-VP1融合蛋白为包被抗原。建立了检测口蹄疫病毒特异性抗的间接ELISA方法。抗原包被浓度为50μg／L时。血清最佳稀释度为1：400，病毒与阳性血清的反应可被Chap10-VP1蛋白阻断，检测的灵敏度为1：1600。     

鸭瘟病毒间接ELISA方法的建立

通过SPF鸡胚进行鸭瘟病毒培养和增殖,采用反复冻融后离心-0.22μm滤膜过滤-差速离心-蔗糖密度梯度离心法(sucrose-density-gradient-centrifugation,SDGC),纯化后病毒粒子作为ELISA包被抗原,从而建立了鸭瘟病毒间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。经对不同血清样品的检测,表明此方法具有操作简便、敏感性高、特异性好的优点,特别适用于大批鸭群的抗体检测和流行病学调查,为合理免疫和疫病预防提供有效的技术手段。     

间接ELISA测定GRF方法的建立

建立了间接ELISA测定生长激素释放因子（GRF）的方法，其工本程序为，抗原包被，5％牛血清白蛋白和5％猎血清封闭，一抗反应（山羊抗人GRF1－29抗体）二抗反应（生物素化兔抗山羊IgG），链霉卵白素－HRP反应，DAB显色，最佳工作条件为，一抗1：1600，二抗1：3200，链霉卵白素－HRP0.5mg/L, 在上述条件下，绘制了标准曲线（2－40ng)，并测定了中国仓鼠肾细胞（CHO）表达GRF的含量。     

牛支原体间接ELISA检测方法的建立

以牛支原体(Mycoplasma bovis)全菌蛋白经超声波裂解后的裂解物作为包被用抗原,建立检测牛支原体血清抗体的间接ELISA方法。通过棋盘滴定法确定抗原最适包被浓度、待检血清最佳稀释度,同时对抗原的包被方式、封闭剂和封闭时间、酶标二抗最佳工作浓度、一抗和二抗最佳作用时间、血清稀释液、底物显色时间进行优化。用该方法测定10份阴性血清的OD450值计算出阴性临界值,并对牛布氏杆菌病、牛病毒性腹泻黏膜病抗血清进行检测。结果:抗原最适包被浓度为200μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100,阴性临界值为0.327。用该方法检测牛布氏杆菌病、牛病毒性腹泻黏膜病抗血清均无交叉反应,表明该间接ELISA具有很好的特异性。     

猪流感抗体间接ELISA检测方法的建立

猪流感病毒A／Swine／Fujian／668／2001（H3N2）株感染的鸡胚尿囊液，经差速离心后，再经蔗糖密度梯度离心，提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融，作为猪流感间接ELISA抗原，确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清进行了检测，经统计学分析，确定间接ELISA判定标准，被检血清OD490nm值≥0．20判定为阳性。该方法对猪瘟等11种猪疫病阳性血清无交叉反应，批内和批间重复试验的吸收变异系数分别在3．34％～8．12％和6．2％～9．04％之间。与HI的符合率达到92．8％，经卡方检验（P〈0．01）比HI试验敏感。为猪流感抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。     

牛皮蝇蛆病间接ELISA诊断方法的建立

以纹皮蝇Ⅰ期幼虫粗提蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了血清最佳稀释倍数为80倍,抗原最佳包被浓度为26.64μg/mL,并对其特异性、敏感性和重复性进行了试验,建立了牛皮蝇蛆病间接ELSIA诊断方法。再以建立的ELISA诊断方法对采自内蒙古地区的233份牛血清进行了检测。结果表明,所建立的牛皮蝇蛆病间接ELISA诊断方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性,可用于牛皮蝇蛆病的血清学检测。     

孔雀石绿间接竞争ELISA检测方法的建立

采用无色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG)单克隆抗体建立了水产品中孔雀石绿(Malachite green,MG)残留的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,LMG-McAb最佳稀释倍数为1∶80 000,包被抗原最佳质量浓度为0.80μg/mL;竞争反应时的LMG理想稀释液为40%乙腈水溶液;标准曲线呈线性相关,相关系数R2=0.9823,最适检测范围1 ng/mL~256 ng/mL,最低检测限为1.29 ng/mL,批内和批间变异系数分别为4.307%和4.566%;鳗鱼肉样的平均添加回收率为90%~110%;该检测方法与隐性结晶紫、孔雀石绿、结晶紫的交叉反应(CR%)分别为40.67%、13.50%和5.89%,与其他抗生素无交叉反应。     

检测牛乳中三聚氰胺的间接竞争ELISA方法的建立

利用戊二醛法合成的三聚氰胺—钥孔匙锥蓝蛋白(KLH)为免疫原制得三聚氰胺的多克隆抗体,并在此基础上以重氮法制备的三聚氰胺—牛血清白蛋白为包被抗原建立了检测三聚氰胺的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,理想的包被抗原质量浓度为0.8mg/L,抗三聚氰胺抗血清的稀释倍数为1:400,最适检测范围为0.03-10mg/L,最小检测量为0.01mg/L,批内与批间变异系数分别为1.952%和6.673%,回归方程为y=-0.4239-0.0933。本实验建立的三聚氰胺含量的间接竞争酶联免疫吸附试验(ci-ELISA)方法可用于牛乳样品中三聚氰胺残留的检测。     

赤羽病间接ELISA检测方法的建立和标化

应用赤羽病病毒(AKV)OBE-1株和牛标准阴阳性血清，以蔗糖密度梯度离心纯化细胞毒为包被抗原，在国内首次建立了检测AKV抗体的间接ELISA方法。该方法与中和试验相关系数0．7614，特异性和重复性良好。应用此方法对南京、上海附近奶牛抽样检测，阳性率分别为26．7％和32．7％。对澳大利亚、加拿大、美国进口牛13600头份进行检测，全部阴性。     

检测牛轮状病毒抗体间接ELISA方法的建立

利用CsCI密度梯度离心化的牛轮状病毒作为包被抗原,建立了检测牛轮状病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(EuSA).用牛病毒性腹泻病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌制备的对照包被抗原与牛轮状病毒阴性和阳性血清反应,其结果均无交叉反应,说明该方法具有良好的特异性,可用于牛轮状病毒抗体的检测.     

应用间接ELISA检测犬冠状病毒抗体

为了建立一种快速、敏感、特异的检测犬冠状病毒（ＣＣＶ）的方法,利用感染ＣＣＶ的犬肾传代细胞包被酶联反应板,以辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌Ａ蛋白（ＨＲＰ－ＳＰＡ）作为第２抗体,建立了检测ＣＣＶ抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。抗原的包被量为每孔３×１０４个染毒细胞,酶标抗体的工作浓度为１∶４０。试验发现,包被的病毒抗原经甲醇固定３０ｍｉｎ后可以提高试验的敏感性,减少病毒抗原的使用量。与中和试验比较证实,２种抗体检测方法的测定结果呈正相关     

检测牛乳κ-酪蛋白的间接竞争ELISA法与间接ELISA法比较

试验旨在建立一种快速简单检测牛乳κ-酪蛋白（κ-CN）含量的酶联免疫吸附（ELISA）方法,为解决牛乳蛋白掺假问题提供一定的技术支持。以牛乳κ-CN为包被抗原,以酶标抗体（HRP-IgG）为检测抗体分别建立间接竞争ELISA法和间接ELISA法,并对两种检测方法进行分析比较。结果表明：对于间接竞争ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为2.5 μg/mL,线性范围为62.5~1 000.0 ng/mL,变异系数< 2%,回收率在98.46%~101.68%;对于间接ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为1.56 μg/mL,线性范围为0.098~3.125 μg/mL,变异系数< 1%,回收率在99.10%~101.06%。比较两种检测方法,间接竞争ELISA法检测耗时较短,抗体应用量较少,而间接法不需要包被成本较高的目标标准蛋白,相关系数也较高,但其检测体系组成成分较多,且需包被待测样品,较难组成ELISA试剂盒体系,不宜用于现场检测。因此,大规模制备ELISA试剂盒体系用于快速检测蛋白含量时可采用间接竞争法,不仅抗体应用量少、节约成本且快速、简单,可更好地用于科研实践。     

间接ELISA检测犬瘟热血清抗体方法的建立

以重组表达的犬瘟热病毒融合蛋白(fusion protein,F)作为包被抗原,建立了检测犬瘟热病毒血清抗体的间接ELISA方法。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为125ng/孔,血清最佳稀释度为1∶160。经阻断试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性较好,可用于犬瘟热血清抗体的定量和定性检测。     

间接ELISA检测羊伪狂犬病抗体的研究

利用差速离心纯化MDBK细胞增殖伪狂犬病毒 (PRV)为抗原 ,建立间接ELISA检测伪狂犬病抗体方法。选用抗原最佳包被浓度为 1∶80 0(4μg/mL) ,酶标兔抗山羊IgG最佳稀释浓度为 1∶80 0 ,作用时间为 60min,封闭物采用 4 %明胶 ,抗原抗体最佳作用时间为 60min。根据建立的最佳反应条件检测伪狂犬病毒油乳剂灭活苗、氢氧化铝凝胶灭活苗、基因缺失油乳剂灭活苗接种山羊后的抗体消长规律。试验表明间接ELISA检测PRV抗体具有快速、敏感、特异等特点 ,适合于大量样品的检测 ,也便于畜群免疫效果的检测和免疫程序的制定     

鸭出血症病毒间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立快速检测鸭出血症病毒(DHDV)的血清学方法,本试验利用浓缩纯化的DHDV作为包被抗原,建立了检测DHDV血清抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化。试验结果表明,抗原最佳稀释浓度为7.06 μg/孔;最佳包被条件为37 ℃ 1 h后,4 ℃包被过夜;待检血清的最佳稀释倍数为1:25。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.44。建立的ELISA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、雏番鸭细小病毒和番鸭呼肠孤病毒阳性血清均无交叉反应,结果表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的最大变异系数分别为0.0221、0.0032,显示该方法具有很好的稳定性,与血清中和试验的符合率为100%。该方法快速、简单、特异性好、重复性好,可用于大批量监测鸭群DHDV血清抗体感染情况。     

间接ELISA检测抗氨苄青霉素抗体方法的建立

通过对最佳抗原包被浓度及包被条件、最佳血清工作浓度、封闭剂、待测血清、酶标二抗的最佳工作浓度及作用时间等反应体系的筛选和确定,利用人工制备的完全抗原及其免疫血清建立了检测抗氨苄青霉素(AMPI)抗体的间接ELISA 方法。结果表明,AMPI BSA抗原最佳包被浓度为1μg/mL,AMPI HSA抗原最佳包被浓度为2μg/mL;包被条件为37 ℃4 h 后4 ℃过夜;抗AMPI HSA血清和抗AMPI BSA 血清最佳工作浓度分别为1∶25 600 和1∶51 200;封闭剂、待测血清、酶标二抗的最佳作用时间均为30 min。血清检测结果表明抗AMPI HSA的抗体水平最高,抗AMPI BSA 的抗体水平稍低于抗AMPI HSA 的抗体,而抗AMPI KLH的最低。     

羊弓形虫病间接ELISA诊断方法的建立

为比较5种弓形虫抗原的诊断效果,建立实用的羊弓形虫病诊断方法,本研究制备了弓形虫速殖子全虫抗原和4个重组蛋白(GRA1、MIC3、MAG、BAG1),正交试验比较其免疫反应性,从中筛选出相对优势抗原并建立羊弓形虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法,用于检测弓形虫特异的IgG抗体。研究结果表明：除BAG1外上述4种抗原均具有较好的免疫反应性,综合考虑选择致密颗粒蛋白1(GRA1)作为诊断抗原建立了GRA1-iELISA,其检测弓形虫抗体灵敏度大于1∶100(血清稀释度),且不与羊莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫、捻转血毛线虫阳性血清发生交叉反应,特异性良好;运用建立的方法和改良凝集试验分别对采自山羊屠宰场的80份血清样品进行检测,测得的弓形虫感染阳性率分别为28.75%(23/80)和31.25%(25/80),二者总符合率为82.5%。本研究建立的ELISA检测方法对羊弓形虫病的诊断以及商业化试剂盒的开发具有重要参考价值。     

猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的PRV抗原为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测PRV血清抗体的间接ELISA诊断方法。标定抗原的最佳包被量为0.802μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为60min,判定标准为OD 450nm值大于0.357为阳性,小于0.296为阴性,在0.296与0.357之间为可疑。该方法检测其他6种常见猪病病毒(CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV)的阳性血清均为阴性;与商品化ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.0%、87.1%、92.3%。本研究建立的PRV间接ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV免疫猪群抗体监测、快速诊断和PR流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

应用间接ELISA检测动物隐孢子虫病抗体

分别应用蔗糖和氯化铯密度梯度离心法纯化小型隐孢子虫（ Ｃｒｙｐ ｔｏｓｐ ｏｒｉｄｉｕｍ ｐ ａｒｖｕｍ ）卵囊,获得高纯度的抗原,建立了用间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测动物隐孢子虫病抗体的方法。抗原最适包被质量浓度是 ５．０ ｍ ｇ／ Ｌ,待检血清最佳稀释度是 １∶１００,明胶封闭体积分数和作用时间分别为 １％ 和 ６０ｍ ｉｎ。试验证明,该法具有快速、简便、特异和重复性好等优点。     

传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了快速检测针对传染性支气管炎病毒(IBV)抗体,本研究建立相应的间接ELISA(iELISA)检测方法。以本实验室分离的临床毒株DS10为检测抗原,经过差速离心纯化获得DS10病毒作为包被抗原,利用方阵试验,优化一系列条件,最终确定了最佳的ELISA反应条件。抗原最佳包被浓度为0.11mg/mL,血清最适稀释度为1:100,封闭液为含1%BSA的PBST,封闭时间为60min,一抗作用时间90min,HRP标记的兔抗鸡IgG稀释倍数为1:3500,作用时间为60min,显色时间为10min。用iELISA方法和血凝抑制试验(HI)同时检测145份血清样品的结果表明,建立的iELISA方法与常规的HI检测的符合率为92.41%,iELISA和HI的阳性检出率分别为92.41%和90.34%,iELISA的敏感性略优于HI。