绵阳地区山羊粪便中捻转血矛线虫的分子鉴定

为鉴定绵阳地区山羊粪便中疑似血矛属线虫虫卵的虫种,本研究提取绵阳地区三个县山羊粪便中疑似血矛属线虫的虫卵DNA 60份,采用PCR技术扩增其核糖体第二内转录间隔区(rDNA ITS-2)基因序列,并与GenBank上公布的捻转血矛线虫同源序列进行比较分析。结果显示:60份疑似血矛属线虫的虫卵DNA样品均得到191bp的ITS-2片段;60条ITS-2序列共形成15条不同的序列,含有17个单变异位点,与GenBank中多株捻转血矛线虫的同源性达95.8%~100%;ML系统发育树显示,本研究得到的15种类型ITS-2序列与已报道的捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)聚类形成一个分支。综上可得,60份来自山羊的血矛属线虫均为捻转血矛线虫。     

基于ITS序列的捻转血矛线虫系统进化分析

为分析捻转血矛线虫ITS序列的变异与虫株特性之间的关系,对捻转血矛线虫不同药物抗性虫株(苯并咪唑类药物抗性虫株、伊维菌素抗性虫株、莫西菌素抗性虫株、药物敏感虫株)、不同宿主来源虫株(长颈鹿、牛、绵羊、山羊、牦牛)和不同地理位置(中国、美国、意大利、法国、也门、马来西亚、澳大利亚)的分离株,以及毛圆科的其他线虫的ITS序列进行了分析。结果发现捻转血矛线虫与毛圆科其他线虫的ITS-2基因的相似性高,基于该基因建立的系统进化树可以很好地区分毛圆科不同属的线虫;捻转血矛线虫的抗药性特点与其ITS-1基因的变异进化关系不大;不同地理位置的捻转血矛线虫分离株的ITS-2基因变异很小;从野生动物长颈鹿体内分离的捻转血矛线虫的ITS-1基因与家养反刍动物分离株的差异较明显。研究结果表明捻转血矛线虫ITS序列在种内相对保守,不同虫株间变异较小,在毛圆科线虫的分子分类中具有一定意义。     

山羊源3种不同形态阴门盖捻转血矛线虫雌虫的多位点序列分析

旨在解析3种不同形态阴门盖捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）的遗传进化差异，本研究从养殖场山羊皱胃中分离到捻转血矛线虫虫体，采用普通光学显微镜观察71条雌虫虫体阴门盖的形态结构特征，并基于捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2和nad4基因位点，采用PCR法对不同阴门盖的虫体进行扩增，通过比对多位点序列进行遗传进化分析。经显微镜观察发现，本研究分离到的捻转血矛线虫雌虫阴门盖存在舌瓣形、亚球形和舌-球混合形3种形态，所占比例分别为45.07%（32/71）、50.70%（36/71）和4.23%（3/71）。对43条雌虫全长和阴门至虫体末端长度进行测量和统计分析，结果显示，3种不同形态阴门盖的捻转血矛线虫全长统计学差异不显著（P>0.05），而3种不同形态阴门盖的捻转血矛线虫阴门至虫体末端的长度存在显著性差异（P<0.05）。基于捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2和nad4基因进行的序列分析结果显示，不同形态阴门盖虫体的9个样品在3个基因位点上存在不同程度的碱基差异，多态性位点分别为10、13和43个，核苷酸多态性分别为0.85%、1.34%和1.97%。基于ITS-1和ITS-2构建的遗传进化树显示，研究中所用样品与GenBank上H.contortus的参考序列处于同一进化支，表明本研究所分离到的虫体均属捻转血矛线虫。捻转血矛线虫雌虫的阴门盖存在形态学差异，不同形态阴门盖虫体在ITS-1、ITS-2和nad4基因位点上均存在不同程度的碱基差异，此研究结果为捻转血矛线虫的种类鉴定和遗传进化提供了参考数据。     

新疆部分地区羊捻转血矛线虫系统进化与抗药性分析

为了解新疆塔城及博乐地区羊捻转血矛线虫的流行情况和系统进化关系,以及这两个地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗药性,在塔城和博乐地区分别收集20、12个羊皱胃分离捻转血矛线虫,进行形态学鉴定、分子生物学鉴定以及抗药性分析。结果显示:在塔城地区的14个羊皱胃内发现有寄生性线虫,通过PCR鉴定出27只捻转血矛线虫;在博乐地区的7个羊皱胃内发现有寄生性线虫,共鉴定出55只捻转血矛线虫。对PCR阳性样品进行测序并应用最大似然法构建系统发育树进行系统进化分析发现:本试验所测序列与GenBank上的捻转血矛线虫虫株序列聚为一支,置信度为100%;与捻转血矛线虫同科不同属的环纹背带线虫虫株序列相聚类,置信度为100%;其外群为不同科、不同属的羊仰口线虫,登录号为KP792295.1;内群与外群分别形成独立的进化分支。对β-tubulin基因进行多序列比对发现,所选样本并未出现苯并咪唑类药物抗性。本研究有助于了解捻转血矛线虫流行情况,并为捻转血矛线虫系统进化及苯并咪唑类药物抗性分析提供了依据。     

黄鳝胃瘤线虫ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

本研究旨在阐明黄鳝胃瘤线虫湖南分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列的遗传变异情况,并用ITS序列重构胃瘤线虫与其它线虫的种群遗传关系.利用聚合酶链反应(PCR)扩增胃瘤线虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析.结果显示所获得的胃瘤线虫ITS及5.8 S rDNA序列总长存在一定差异(922～927 bp),其中包含部分的18S、28 S及全部的ITS-1 (350～351 bp)、5.8S(102 bp)及ITS-2 (340～344 bp)序列.本研究系国内首次报道胃瘤线虫的ITS序列,其结果为黄鳝胃瘤线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

山羊捻转血矛线虫ITS基因序列分析

为了解不同年份山羊源捻转血矛线虫内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)基因的遗传变异情况,提取2015年-2020年间陕西省咸阳地区44株山羊源捻转血矛线虫的核糖体DNA(rDNA),对其ITS基因进行扩增、测序与分析.结果显示,44株捻转血矛线虫的ITS-1序列长度为400 b...     

双盲口线虫ITS rDNA的PCR扩增及序列分析

以从波兰大西洋鳕体内采集的8条双盲口线虫样品为研究对象,利用保守引物通过PCR扩增其核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)ITS-1 rDNA、5.8S rDNA、ITS-2 rDNA后,将扩增片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,经PCR及酶切鉴定后,对获得的阳性质粒DNA进行序列分析。结果显示,所获得的ITS rDNA及5.8S rDNA序列总长存在一定差异,ITS rDNA为885～927 bp,包含18S rDNA、28S rDNA部分序列及ITS-1 rDNA(441～449 bp)、5.8S rDNA(155 bp)和ITS-2rDNA(266 bp)全部序列。结果表明,双盲口线虫ITS序列种内相对保守(ITS-1 rDNA:0～2.2%;ITS-2 rDNA:0～3.4%),而种间差异较大(ITS-1 rDNA20%;ITS-2 rDNA35%),可作为种间遗传变异研究的标记。本研究结果为双盲口线虫的分子鉴定、种群遗传学以及双盲口线虫病的进一步研究提供了参考和依据。     

林麝捻转血矛线虫的分子鉴定

为鉴定林麝粪样中疑似血矛属线虫虫卵的虫种,本研究提取四川和陕西地区林麝粪样中疑似血矛属线虫的虫卵DNA,对其核糖体内转录间隔区(ITS)全序列进行PCR扩增与序列分析。结果显示14个疑似血矛属线虫的虫卵DNA样品ITS全序列片段大小为786 bp~788 bp,序列相似性为99.0%~100%;经序列BLAST比对和系统发育分析,所有疑似血矛属线虫的虫卵样品均为捻转血矛线虫,与NCBI基因库中多株捻转血矛线虫的ITS序列相似性为97.0%~99.5%。研究结果表明,寄生于林麝的血矛属线虫为捻转血矛线虫,从而为控制林麝捻转血矛线虫病提供了重要依据。     

羊常见肠道蠕虫病的防治

正最近,在羊场进行肠道蠕虫感染情况调查时发现,羊捻转血矛线虫、食道口线虫、网尾线虫、毛首线虫及莫尼茨绦虫的发病率较高,要引起养羊场(户)的关注。(一)羊捻转血矛线虫病羊捻转血矛线虫病是由捻转血矛线虫寄生在羊、牛等反刍动物真胃(皱胃)和小肠内的一种常见寄生虫病,也叫羊捻转胃虫病。1.病原。羊捻转血矛线虫外观呈毛发状,呈淡红色。颈乳突显著,呈锥形,伸向后侧方。头端尖     

捻转血矛线虫Hc38基因的克隆及其RNAi载体的构建

根据RNAi目标序列的选取原则和捻转血矛线虫Hc38基因(登录号AY749124)产物的保守结构域所在核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从绵羊捻转血矛线虫雌性成虫中扩增出约400bp cDNA序列,与AY749124序列同源性为99%.将目的序列亚克隆到RNAi载体L4440中,经PCR和酶切鉴定证明,成功构建了捻转血矛线虫对应于Hc38基因的RNAi载体L4440-Hc38.     

鸡蛔虫凉山州分离株ITS和5.8SrDNA序列测定及种系发育分析

应用保守引物BD1和BD2对7个鸡蛔虫凉山州分离株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S rDNA序列进行PCR扩增和序列测定,并用ITS-1、ITS-2序列重构鸡蛔虫与其他蛔虫的系统发育关系。测序结果显示所获得的鸡蛔虫ITS及5.8S rDNA序列大小为974~989 bp,同源性为98.9%~100.0%。其中ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2片段大小分别为473~481、157和337~359 bp,同源性分别为98.5%~100.0%、100.0% 和98.5%~100.0%。系统发育树显示所有鸡蛔虫分离株聚在同一分支,能与其他蛔虫相区别。研究结果表明,鸡蛔虫的ITS-1、ITS-2序列种内变异小,但种间差异大,故可作为分子标记用于鸡蛔虫的虫种鉴定,为鸡蛔虫的分子分类、分子流行病学调查和种群遗传的进一步研究奠定基础。     

Characterization of Bunostomum trigonocephalum and Bunostomum phlebotomum from sheep and cattle by internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA

In the present study, samples representing Bunostomum trigonocephalum and Bunostomum phlebotomum from sheep and cattle in Heilongjiang Province, China, were characterized and grouped genetically by the first (ITS-1) and second (ITS-2) internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA (rDNA). The rDNA region including the ITS-1, 5.8S, ITS-2, and flanking 18S and 28S rDNA sequences was amplified by polymerase chain reaction (PCR), then sequenced and compared with that of other members of the hookworms available in GenBank?, and phylogenetic relationships between them were reconstructed using the Maximum-Parsimony method. The ITS-1, 5.8S, and ITS-2 sequences of the sheep hookworm were 381, 153, and 231 bp in length, respectively, and the corresponding sequences of the cattle hookworm were 392, 153, and 240 bp in length. The identity of ITS sequences of B. trigonocephalum and B. phlebotomum from sheep and cattle was 87.4%. A PCR-linked restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay using restriction endonuclease Nde I was established for the unequivocal differentiation of the two hookworm species. Phylogenetic analyses based on the ITS sequences revealed that B. trigonocephalum and B. phlebotomum were closely related, but they represent two different species.     

斑马蛔虫ITS及5．8SrDNA的克隆及进化分析

研究从斑马体内分离的蛔虫的核糖体DNA内转录间隔区（ITS）及5．8SrDNA序列的遗传变异情况,并用ITS序列重构斑马蛔虫与其它蛔虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应（PCR）扩增斑马蛔虫rDNA的ITS-1、5．8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM．TEasy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示所获得的斑马蛔虫ITS及5．8SrDNA序列总长为892bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS,1、5．8S及ITS．2序列。证实从斑马体内分离的蛔虫为马副蛔虫,从而为斑马蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查奠定了基础。     

蛇蛔虫ITS及5.8S rDNA的克隆及进化分析

利用聚合酶链反应（PCR）扩增蛇蛔虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,所获得的蛇蛔虫ITS及5.8SrDNA序列总长为846bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS-1、5.8S及ITS-2序列。本研究系国际上首次报道蛇蛔虫的ITS序列,从而为蛇蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查奠定了基础。     

3种冠环线虫rDNA-ITS的PCR扩增及序列分析

本试验利用PCR扩增3种冠环线虫5个样品的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S片段,将PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定和分析。序列比对和分析结果显示,所测样品ITS1-5.8S-ITS2的长度范围为748~843 bp,总变异位点(包括gaps)119个,简约信息位点18个;其中ITS1和ITS2的长度范围分别为367~370 bp和228~320 bp,变异位点分别为14个和105个,简约信息位点均为9个。所有测试样品的5.8S片段完全相同,长度为153 bp。5条序列ITS1区的G+C含量(48.0%~48.5%)明显高于ITS2区(37.7%~40.3%)。通过序列两两比对,3种冠环线虫ITS1和ITS2的种间差异性分别为1.9%~3.5%和5.6%~31.8%;而种内差异性分别为0~0.5%和0~0.9%。并且所测序列与GenBank中已知序列的同源性为99.07%~99.41%。本研究认为,ITS序列可以作为冠环线虫种类鉴定的分子标记。     

基于ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列兔肝球虫PCR检测方法的建立

通过对多种鸡球虫和松鼠球虫18S rRNA和28S rRNA进行序列比对分析,在18S rRNA 3’端和28S rRNA 5’端保守区设计艾美耳属通用引物,以斯氏艾美耳球虫洛阳分离株LY卵囊基因组DNA为模板首次成功克隆到斯氏艾美耳球虫完整的ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列,其大小为1178bp,其中ITS1序列长度为423bp,5.8S rRNA为155 bp,ITS2为600 bp,斯氏艾美耳球虫LY株ITS1/2序列高度变异,与鸡球虫、啮齿动物球虫的序列同源性低于60%。然后在斯氏艾美耳球虫ITS1/2序列超变区设计种特异引物,建立了灵敏、特异的PCR检测方法。本研究结果将为兔球虫强致病种的临床诊断和揭示兔球虫种群遗传特征提供有效的分子工具。     

斯氏艾美耳球虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列的克隆及PCR检测方法的建立

通过对多种鸡球虫和松鼠球虫18SrRNA和28SrRNA进行序列比对分析,在18SrRNA 3′端和28SrRNA 5′端保守区设计艾美耳属通用引物,以斯氏艾美耳球虫洛阳分离株LY卵囊基因组DNA为模板首次成功克隆到斯氏艾美耳球虫完整的ITS1-5.8SrRNA-ITS2序列,其大小为1 178bp,其中ITS1序列长度为423bp,5.8SrRNA为155bp,ITS2为600bp,斯氏艾美耳球虫LY株ITS1/2序列高度变异,与鸡球虫、啮齿动物球虫的序列相似性低于60%。然后在斯氏艾美耳球虫ITS1/2序列超变区设计种特异引物,建立了灵敏、特异的PCR检测方法。本研究结果将为兔球虫强致病种的临床诊断和揭示兔球虫种群遗传特征提供有效的分子工具。