茶树CsRAV2转录因子基因的克隆与表达特性分析

RAV转录因子是AP2/ERF家族的成员之一,在植物生长发育和逆境调控中起着重要作用。本研究以安吉白茶和迎霜这两个茶树（Camellia sinensis）品种为试验材料,通过PCR和RT-PCR方法分别从两种茶树的DNA和cDNA中克隆得到CsRAV2基因。分析显示,来源于两种茶树中的CsRAV2基因全长均为1 089 bp,没有内含子,分别编码362个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示,茶树中CsRAV2转录因子是亲水性蛋白。茶树中CsRAV2转录因子与拟南芥AtRAV具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明,茶树中CsRAV2基因在茶树根中表达量最高,高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达,不同品种间存在差异。     

白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。     

茶树CLH基因家族的鉴定与转录调控研究及其在白化茶树中的表达分析

叶绿素酶（Chlorophyllase,CLH）是叶绿素降解过程中的关键酶,将叶绿素a脱去植醇,形成脱植基叶绿素a。以白化茶树白鸡冠新梢叶片为材料,克隆获得3条CsCLHs基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析。结果表明,3条CsCLHs基因分布于2个亚家族,其蛋白质编码区（Coding sequence,CDs）长度为894~975 bp,编码氨基酸个数为297~324,蛋白质分子量为31.99~34.91 kDa,等电点为4.89~7.61,不稳定系数为38.94~48.24,其中CsCLH1.1和CsCLH1.2为不稳定蛋白,CsCLH2为稳定蛋白。Cell-PLoc亚细胞定位预测结果表明,3个CsCLHs蛋白均定位于叶绿体;而WolfPsort亚细胞定位预测结果显示,CsCLH1.1和CsCLH1.2定位于细胞质,CsCLH2定位于叶绿体。遮阴和恢复光照处理下的qRT-PCR结果显示,遮阴抑制白鸡冠叶片CsCLHs的表达,光照诱导白鸡冠叶片CsCLHs的表达。不同品种中CsCLHs表达模式分析表明,CsCLH1s在白化叶中高表达。另外,酵母单杂交结果表明,CsCDF5可以与CsCLH1.1和CsCLH2启动子结合。综上所述,CsCLHs在白化茶树叶片中可能参与叶绿素降解,在叶片白化过程中发挥重要作用,结果可为进一步探究茶树CLH基因家族的功能及茶树叶片白化机理提供参考。     

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT（P51094.2）的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

苎麻胞液型谷氨酰胺合成酶基因的克隆和超量表达载体构建

谷氨酰胺合成酶是植物氮代谢途径中的关键酶,分为胞液型(GS1)和质体型(GS2)两种。本文首次从苎麻中克隆了一个胞液型谷氨酰胺合成酶基因BnGS1-1,并利用生物信息学对其序列和结构特征进行了分析。该基因序列全长1205 bp,含有一个1071 bp的ORF区,编码356个氨基酸残基的多肽,pI和Mw分别为5.64和39.19 KDa,具有beta-Grasp和catalytic两个保守功能域;蛋白序列在56、92、249和297位点分别为Asp、Cys、His和Glu。系统进化分析表明BnGS1-1与大豆(Glycine max)、四季豆(Phaseolus vulgaris)、苜蓿(Medicago sativa)、棉花(Gossypium raimondii)在同一个分支上。同时,将BnGS1-1与pBI121载体利用同源重组技术,成功构建了植物超量表达载体。因此,本研究为了解和改善苎麻饲用特性提供了物质和理论基础。     

夜来香SAMT基因的分离与原核表达

为探究夜来香（Cestrum nocturnum）花香基因SAMT在花香代谢中的调控作用,以花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合,克隆夜来香SAMT基因的全长cDNA。结果表明：该cDNA的序列长度为1 493 bp,编码365个氨基酸,其中包含1 098 bp ORF、130 bp 5′UTR和265 bp 3′UTR,将其命名为CnSAMT;生物信息学分析结果表明：该基因所编码的氨基酸序列与烟草、番茄的同源性分别为98％和98％,属于甲基转移酶-7家族;原核表达结果表明：CnSAMT的蛋白表达产物约为42 ku,与软件预测的结果大致相同。采用染色体步移技术,克隆夜来香CnSAMT的5′端调控序列,结果表明：该序列长度为993 bp,且该序列除了含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件外,还含有光、生长素、脱落酸、热胁迫、缺氧胁迫等外界环境条件响应的顺式作用元件。     

青天葵独脚金内酯信号转导关键基因D14的克隆与亚细胞定位分析

D14基因是独脚金内酯信号转导途径的关键基因,其编码的蛋白能够使SLs释放出活性小分子物质而发挥调节腋芽起始的功能。本研究根据其他物种的D14基因从青天葵转录组数据中筛选获得2条高度同源的片段,命名为NfD14a和NfD14b。应用RT-PCR和RACE技术,克隆获得NfD14a和NfD14b的cDNA全长序列,GenBank登录号分别为MH028026、MH028027。NfD14a基因全长1206 bp,ORF为861 bp,编码286个氨基酸;NfD14b基因全长1082 bp,ORF为813 bp,编码270个氨基酸。对NfD14的编码蛋白序列进行了生物信息学分析,结果表明：NfD14a和NfD14b均属于α/β折叠蛋白水解酶超家族成员（Abhydrolase superfamily）,但系统进化分析结果表明两者同源性不高。利用一步快速克隆的方法构建了植物表达载体35S::NfD14a-EGFP和35S::NfD14b-EGFP,并分别获得其工程菌。瞬时表达结果表明,NfD14a和NfD14b均定位在烟草原生质体的细胞核和细胞质。本研究通过对NfD14基因全长cDNA序列的克隆与亚细胞定位分析,为青天葵独脚金内酯信号转导途径调控植物分枝生长发育机制的研究奠定基础。     

甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的克隆及其表达分析

△~1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程的关键酶.应用同源性克隆结合RACE技术获得甘蔗PSCS基因cDNA全长序列2714bp,其中5'端非编码区为226bp,3'端非编码区340bp,poly(A)上游有1个聚腺苷酸五碱基AATAAA;开放读码框为2 148 bp编码715个氨基酸,含双功能域;其编码的蛋白分子量为77.7 ku,等电点为6.47.序列比对分析结果表明,P5CS基因的4个主要功能区(domain)中亮氨酸功能区(Leucine domain)相对不保守,其它功能区均较为保守.对17个物种的P5CS基因进行聚类分析,结果与公认的生物学分类及进化关系吻合.对甘蔗P5CS在根、茎、叶的表达进行实时PCR分析,结果表明,该基因在茎、叶表达量相近,但在根的表达量极低.     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

辣椒小G蛋白CaRab8基因全长cDNA的分离及表达特征的初步分析

通过对辣椒均一化cDNA文库的筛选,分离获得了一个与烟草RAB8-2基因编码的蛋白有着高度同源性的cDNA阳性克隆,命名为CaR ab8.测序结果表明,该cDNA长度为961 bp,包含有651 bp的完整的开放阅读框,推测编码一个217个氨基酸的蛋白,该蛋白具有GTP/GDP结合活性必需的保守域和包括YYRGA在内的...     

巴西橡胶树胶乳亮氨酸氨肽酶基因克隆及表达

以巴西橡胶树(Hevea Brasiliensis)无性系热研7-33-97的胶乳为材料,根据已报道的植物亮氨酸氨肽酶基因的保守序列设计简并引物,应用RACE技术克隆同源基因(HbLAP1).用生物信息学软件(DNA-MAN,DNAStar,ScanProsite,ClustalW)对HbLAP1进行生物信息学分析,通过Northern-blot分析HbLAP1的表达.结果表明,HbLAP1的cDNA全长1 985 bp,包括1个1 581 bp的阅读框,编码526个氨基酸的蛋白质,一个105 bp的5'非编码区和一个299bp的3'非编码区(括16个腺苷酸尾巴);HbLAP1是一种可溶性的细胞质氨肽酶结构域,割胶显著下调舶HbLAP1的表达.HbLAP1可能是乳管细胞茉莉酸信号途径的负调控因子.     

茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一,含有许多有价值的次生代谢产物,如儿茶素类物质。分离和克隆重要的茶树功能基因,对利用基因工程技术进行茶树遗传调控具有重要意义。本文采用EST测序技术和T4RNA连接酶介导的5′RACE技术,获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因—查尔酮异构酶（CHI）基因,在GenBank登录（DQ904329）,其序列全长1 163 bp,其中开放阅读框长723 bp,编码240个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为26.4 kD,理论等电点为5.19。序列分析表明它与番茄CHI基因序列的亲缘关系比较近。