转HAL1基因大豆侧翼序列分析及特异性检测方法研究

为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。     

一个调控大豆根瘤数量的GmWUS2基因功能研究

豆科植物的结瘤固氮作用在农业上具有减肥增效、改良土壤等重大意义.WUS基因在植物分生组织中具有重要作用.基于已公布的大豆基因组数据对该基因进行生物信息学分析,表明大豆WUS基因(GmWUS)和模式植物拟南芥WUS基因(AtWUS)的编码蛋白在氨基酸序列上相似度较高,但在酸性区域存在较大差异.从大豆品种天隆1号基因组中扩...     

大豆异黄酮还原酶基因的鉴定及生物信息学分析

异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物,是大豆主要的功能活性成分之一。异黄酮还原酶(isoflavone reductase,IFR)是异黄酮分解途径的关键酶之一,在调控异黄酮含量及成分方面起着重要作用。本研究基于大豆全基因组测序数据,利用生物信息学方法鉴定了大豆异黄酮还原酶基因家族成员,并对其基因的序列特征、结构特征和遗传多样性进行了分析。结果表明:大豆异黄酮还原酶(GmIFR)家族含有17个成员,蛋白序列介于191(GmIFR07)和376(GmIFR11)个氨基酸之间,序列相似性为19.59%(Gm IFR07和GmIFR11)~98.43%(Gm IFR12和GmIFR17),结构分析表明这些基因内含子数目差异较大,2~6个不等,不均匀的分布在大豆的1、4、6、9、11、12和16号染色体上。     

HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化

大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。     

Aux/IAA基因家族鉴定及对大豆茎尖发育的调控作用分析

Aux/IAA基因家族在植物茎尖发育过程发挥重要作用.为了探究大豆Aux/IAA基因家族在大豆茎尖发育过程的调控作用,本文以拟南芥Aux/IAA基因家族蛋白序列为参照鉴定了大豆全基因组Aux/IAA家族基因,包括63个成员;然后以拟南芥、鹰嘴豆和大豆的Aux/IAA家族为研究对象,比对这些基因全长氨基酸序列并构建进化树...     

转GmGT-2B基因大豆的耐盐性分析

采用盆栽试验方法,苗期在盐胁迫条件下,比较GmGT-2B转基因大豆与非转基因大豆的损伤程度、超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、脯氨酸和K~+、Na~+含量以及基因表达量变化差异。结果表明:盐胁迫对转基因大豆叶片的伤害程度明显低于对照;SOD活性、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量在盐胁迫5 d后均与对照有显著或极显著差异;植株的Na~+含量随盐胁迫时间的增加而升高,在胁迫第8天转基因大豆的Na~+含量达到对照约2倍;转基因大豆的基因的表达量呈上调趋势,在第8天达到表达高峰。基因表达量的变化趋势与生理指标SOD活性、脯氨酸含量和Na~+含量表现的一致。结果表明GmGT-2B基因与盐应答反应有关,其中转GmGT-2B大豆株系N11和N24盐害程度较低,该基因和转GmGT-2B基因大豆具有较大的应用价值。     

茶网蝽线粒体基因组全序列测定及系统发育分析

为明确茶网蝽（Stephanitis chinensis）线粒体基因组序列特征,探究其系统发育地位。利用Illumina和Sanger测序对陕西省安康市茶网蝽线粒体基因组进行测定。结果显示,茶网蝽线粒体基因组全长18 085 bp,包含37个基因（13个蛋白质编码基因,22个tRNA,2个rRNA）和1个3 678 bp的控制区,基因排列与昆虫线粒体祖先基因顺序（Ancestral gene order）相同。基因组AT含量为78.10%。13个蛋白质编码基因中,6个以ATG起始,7个以ATT或ATA起始,10个以TAA或TAG为终止密码子,cox2、atp6和cox3以T终止,蛋白质编码基因使用频率最高的密码子是UUA、AUU、UUU和AUA,使用频率最高的氨基酸为亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）和丝氨酸（Ser）。22个tRNA基因存在GU、UU、GA和AA错配23处,trnS1(GCU)缺少DHU臂,其他tRNA均能形成典型三叶草结构。控制区包含位于前端的3种非串联重复、4个(TTAG)_n和1个位于后端的串联重复序列,含有多个茎环结构。系统发育分析结果表明,茶网蝽与直脊冠网蝽（Stephanitis mendica）的亲缘关系最近,所有网蝽科聚为一簇,位于发育树的根部。     

过表达GmNHX1基因提高大豆根系的耐盐性

Na+/H+反向转运蛋白可调控细胞质pH值、钠离子浓度和细胞体积,从而减轻盐胁迫对植物的伤害.利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导法,向大豆根系导入由CaMV35S启动子调控的Na+/H+反向转运蛋白编码基因GmNHX1的cDNA序列,通过该基因的过量表达,提高大豆的耐盐性.通过潮霉素...     

转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

大豆种子Em基因(LEA 1)启动子的克隆与序列分析

根据已公布的大豆种子Em基因(LEA1)的5'末端序列设计二个基因特异反向引物(EmS1,EmS2).以大豆基因组DNA为模版,利用染色体步行(Chromosome Walking)法,获得了Em基因起始密码子上游836bp的特异DNA片段.进行序列测定和生物信息学分析.结果表明,这段DNA序列为一尚未在基因数据库登录的DNA片段.该序列含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,因此可能具有启动子活性.含有1个DRE1和2个ABRE,该启动子可能受到ABA和干旱等条件的诱导.含有1个AG-motif和1个ELRE-motif,该启动子可能参与创伤和诱导子等胁迫因素的应答.含有2个RY-repeat和1个TGTCACA-Motif,该启动子片段可能具有种子特异性.结果表明,所克隆到的片段可能为基因Em的诱导型启动子,并且很可能是种子特异性启动子.     

小麦PM H+ ATPase基因克隆及其推定的蛋白结构分析

为了解小麦PM H~+-ATPase的基因全序列及其相关生物信息学特征,以豫麦18的基因组DNA为材料,用Full-Tail-PCR方法首次克隆到了小麦PM H~+-ATPase基因的启动子,并用分段克隆方法克隆了其全长序列(登录号:AY829002).DNA序列分析结果表明,该基因全长5 770 bp,含有15个外显子和14个内含子,其中第一个内含子片段较大,长达1 432 bp.碱基组分分析结果表明,该基因的启动子及5′UTR全长分别为161和201 bp,G+C含量分别高达72.1%和72.6%.对其生物信息学特征分析结果表明,该蛋白由951个氨基酸组成,分子量为104.6 kD,有44个功能位点,10个跨膜区,1个Cation-ATPase结构域,1个E1-E2-ATPase结构域和1个水解酶结构域.与其他植物序列比对分析结果表明,不同植物来源PM H~+-ATPase具有较高的保守性.该基因结构及其推定产物结构的复杂性说明该基因在生命活动调节中的精确性.     

水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析

根据Thanatephorus cucumeris G蛋白β亚基序列（AY884129）设计引物,对水稻立枯丝核菌AG 1IA的 G蛋白β亚基基因进行了克隆。PCR结果得到1条约为1.9 kb的扩增片段,包含1个约1.7 kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。同源性检索发现该序列与大量Ｇ蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于57.34%~88.14%。根据其推导cDNA序列设计引物进行RT PCR分析,发现该基因在对数生长期表达量最高,提示水稻立枯丝核菌AG 1IA G蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。     

水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal（AB002266）的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

密植夏玉米穗部脱水及力学特性研究

以仲玉3号和正红6号玉米为试材,设置6.75×10⁴、8.25×10⁴株/hm²两个种植密度,研究密植条件下夏玉米子粒、穗轴脱水及力学特性的变化规律,探明二者之间的关系。结果表明,随着种植密度的增加,穗部器官脱水减慢、含水率增加,力学强度呈下降趋势。品种间穗部脱水及力学强度存在显著差异,且远大于种植密度及二者交互作用的影响。与正红6号(ZH6)相比,仲玉3号(ZY3)脱水较快,到达适宜机械粒收含水率时所需吐丝后积温较少,收获时ZY3子粒压碎强度与穿刺强度大,穗轴抗折断力小,茎秆倒伏率低,机收性能更好。相关性分析显示,子粒与穗轴力学强度与含水率均呈显著负相关;穗轴抗折断力与干重、单位长度干重及单位体积干重呈极显著正相关,与穗轴长、长粗比呈极显著负相关。密度与品种对子粒产量存在无显著差异,随着种植密度的提高,茎秆倒伏率显著增大,ZY3生理成熟后脱水速率显著降低,达到宜机收子粒含水率所需积温增多。     

万恢88型水稻细胞质雄性不育的分子机理

通过对万恢88型水稻细胞质雄性不育系内香2A与其保持系线粒体基因组进行比较分析,研究了其雄性不育的分子机理。将不育系内香2A与保持系内香2B的差异片段回收测序,获得2条长度为667 bp的线粒体DNA片段2A和2B,通过序列比对和电子杂交分析,获得的线粒体DNA片段为atp6基因的部分序列及其上游序列。2A与2B相比有3个碱基不同,分别是第57位G→T、第100位T→C、第161位C→T。功能分析表明,第100位T→C点突变使atp6基因启动子核心序列遭到破坏。通过对atp6基因上游序列的RT-PCR分析,发现不育系内香2A的atp6基因不能正常表达。推测万恢88型水稻细胞质雄性不育是由于不育系线粒体atp6基因核心启动子区域发生点突变,导致atp6基因不能正常转录,致使线粒体供能不足,最后导致花粉败育。     

兰科植物FNR基因的密码子偏好性分析

为揭示兰科植物FNR基因的特性和密码子偏好性，采用DNAMAN、CodonW和SPSS软件及 EMBOSS、SWISS-MODEL在线网站对17种兰科植物的FNR基因序列、氨基酸序列、同源区域及蛋白质三维结构进行分析。结果表明：兰科植物FNR基因普遍具有在A/T(U)与G/C之间较弱的密码子偏好性；密码子的末位在A和T(U)之间存在显著的T(U)偏好性，在C和G之间存在显著的C偏好性；NADP结合域比非结合域有较小的密码子偏好性；基于CDS和氨基酸聚类结果比基于RSCU聚类更接近于植物的进化分类；自然选择的作用是导致兰科植物FNR基因的密码子使用偏好性的主要成因。     

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。     

湖南益阳黑茶中桔青霉线粒体全基因组序列测定及分析

对黑茶中分离的一株桔青霉线粒体基因序列进行测定与分析,并探究其与近缘种微生物的系统发育关系。结果表明,桔青霉线粒体基因组是一条全长27β537βbp的环状DNA分子,共编码42个基因（15个蛋白质编码基因,2个rRNA,24个tRNA以及1个独立的ORF）,基因组碱基构成为：A（36.17%）、T（37.06%）、C（11.82%）、G（14.95%）。15个蛋白质编码基因均采用典型的ATG作为起始密码子、TAA或TAG作为终止密码子,基因排列顺序与已报道的青霉属物种相似,在进化上较为保守。蛋白质编码基因编码频率较高的氨基酸分别为Leu、Ile、Ser和Phe;RSCU频率最高的4个密码子依次是UUA、AUA、UUU和GGU。24个tRNA基因存在30处G-U错配,均可形成典型三叶草结构。系统发育分析结果表明,桔青霉分类地位上关系最密切是Penicillium ShG4C,其次是Penicillium polonicum与Penicillium nordicum。     

基于数字图像分析技术的橡胶树叶片氮含量预测

为建立橡胶树氮素营养快速诊断技术,利用数码相机获取橡胶树叶片图像,运用数字图像处理技术提取叶片图像的颜色特征参数,分析颜色特征参数与橡胶树叶片氮含量的相关性,并建立回归模型。结果表明,9个颜色特征参数R/B、B/(R+G)、R/(G+B)、R/(R+G+B)、B/(R+G+B)、(B+G)/(R+G+B)、(R-B)/(R+G+B)、(R-B)/(B+R)和G/(R-B)与橡胶树叶片氮含量相关性较好,综合评价得出G/(R-B)所建立的橡胶树热研7-33-97叶片氮含量二次多项式估测模型最优,模型校正决定系数为81.04％,预测相对误差和均方根误差分别为10.91％和0.31％,表明利用数字图像分析技术可以进行成龄橡胶树热研7-33-97叶片氮素含量营养诊断。