PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb.测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

香蕉ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及毒性与自激活效应检测

用PCR技术获得香蕉ROP1基因片段,构建酵母双杂交系统表达载体pGBKT7-ROP1,测序正确后将重组质粒导入AH109酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.结果表明,用PCR技术获得了正确的ROP1基因片段,并正确构建了ROP1基因的酵母双杂交表达载体,并转化到AH109酵母菌株中,含诱饵载体的AH109在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,含诱饵载体的AH109在His、Trp二重营养缺陷平板上不能生长,说明对报告基因无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统筛选与ROP1蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及白激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白（CP、HC-Pro、CI）互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选。通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响。结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性。     

OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测

采用PCR技术扩增水稻（Oryza sativa L）根UV-B敏感基因1（ROOT UV-B SENSITIVE 1,RUS1）四个不同片段[OsRUS1（1-1782）、OsRUS1（1-504）、OsRUS1（510-1282）、OsRUS1（1188-1782）],连接到T载体pMD18-T-Simple上,测序无误后分别亚克隆到诱饵载体pGBKT7上,酶切和测序结果表明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体构建成功,读码框正确;转化重组载体于酵母感受态细胞Y187中,用LacZ、MEL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD-Trp-DO培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明诱饵载体对酵母菌株Y187没有转录激活活性和毒害作用。说明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步从水稻cDNA文库中筛选互作蛋白奠定了基础。     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选.通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响.结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性.     

红麻酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)酵母双杂交诱饵载体构建及自激活检测

酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)是超长链脂肪酸合成过程中的限速酶,参与超长链脂肪酸和蜡质的合成,在植物抗旱和应对生物胁迫反应中发挥重要调控作用。研究采用PCR方法从红麻中(茎皮)分离KCS基因片段,将该基因按正确方式插入酵母双杂交表达质粒pGBKT7中,酶切鉴定正确后,用PEG/Li Ac方法转化酵母MaV203,经抗性筛选后,用X-Gal对转化酵母进行自激活检测。结果表明,KCS基因的DNA结合结构域与酵母GAL4转录因子的上游激活位点(UAS)结合,可激活报告基因半乳糖苷酶的表达。经删除KCS基因DNA binding区域后重新转化酵母,结果表明,不携带KCS基因DNA binding区域的截短蛋白可以作为诱饵蛋白来研究与之相互作用的蛋白。     

酵母双杂交系统筛选与水稻条纹病毒Pc2互作的寄主蛋白基因片段

水稻条纹病毒编码的Pc2蛋白在病毒侵染及宿主症状发生中起作用。研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染与致病的分子机制。分别将编码Pc2 N端（Pc2-N）与Pc2 C端（Pc2-C）的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上，并构建水稻叶片cDNA文库，然后分别用Pc2-N和Pc2-C为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明，诱饵载体中插入的Pc2-N和Pc2-C编码框和氨基酸序列均正确。Pc2-N对酵母菌株AH109无毒性和自主激活能力，但Pc2-C对酵母具有细胞毒性。文库滴度为4×107 CFU/mL，且大多数插入片段在500~2 000 bp之间。利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库，获得有8个候选阳性克隆。经序列测定和BLAST分析结果表明，这些克隆共编码5种蛋白，主要为胁迫相关蛋白与光系统相关蛋白。     

与水稻黑条矮缩病毒p5b互作的水稻基因片段筛选

 由水稻黑条矮缩病毒基因组S5片段第2个开放阅读框（ORF）编码的p5b是一个功能未知的病毒非结构蛋白。构建了酵母双杂交体系的含水稻cDNA表达文库的pGADT7载体,同时将p5b 基因构建到诱饵质粒pGBKT7上（pGBK p5b）,Western Blot和自激活实验结果显示p5b可在酵母中正确表达且无自激活活性。进一步利用p5b蛋白作为诱饵用酵母双杂交筛选水稻cDNA表达文库,鉴定出一些参与光合作用、呼吸作用等重要代谢过程的关键酶基因片段,这些酶可能与p5b蛋白之间存在相互作用,推测这些互作在病株症状发展过程中起作用。     

橡胶树14-3-3蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

以克隆到的3个编码橡胶树14-3-3蛋白的基因HbGF14a、HbGF14b、HbGF14c和为基础,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-HbGF14a、pGBKT7-HbGF14b、pGBKT7-HbGF14c,并对其进行自激活和毒性实验鉴定.自激活实验结果表明,3个诱饵载体没有自激活性;毒性实验结果表明,pGBKT...     

利用酵母双杂交系统鉴定玉米Pto蛋白与Pti1蛋白间的相互作用

玉米类Pto以及类Pti1基因参与多种逆境胁迫的信号传导。本研究分别将玉米ZmPto基因、ZmPti1a和ZmPti1b基因插入酵母表达载体pEG202和pJG4-5中,利用酵母双杂交的方法验证玉米类Pto以及类Pti1蛋白的相互作用。结果表明,无论是携带空载体还是携带一个(ZmPti1或ZmPto)融合蛋白的菌株都不能激活报告基因,只有同时携带ZmPti1和ZmPto蛋白的菌株可以激活报告基因,初步确定ZmPto蛋白与ZmPti1蛋白存在相互作用。     

巴西橡胶树乳管细胞中与HbRZF相互作用蛋白的初步筛选与分析

为深入研究巴西橡胶树乳管细胞中C3HC4型环锌指蛋白HbRZF的生物学功能,构建了pGBKT7-HbRZF诱饵表达载体,利用酵母双杂交技术从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR测序和生物信息学分析,初步获得了16个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.获得乳管细胞中与HbRZF相互作用蛋白,为进一步研究HbRZF锌指蛋白在巴西橡胶树乳管细胞中的未知生物学功能奠定了重要基础.     

用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。     

香蕉条斑病毒ORFⅠ、ORFⅡ酵母双杂交系统诱饵质粒的构建及鉴定

以连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒(BSV)全基因组为模板，PCR扩增得到了带有GatewayR重组反应接头序列的香蕉条斑病毒ORFⅠ及ORFⅡ基因片段，经过BP、LR重组后，构建成带有目的片段的酵母双杂诱饵质粒pDEST32-O1及pDEST32-O2。将质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，筛选序列和编码框均正确的重组质粒。将以上2种正确的重组质粒分别与用于构建诱饵质粒的pDEST22空质粒共转化酵母MaV203感受态细胞，利用营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp)筛选转化子，并对转化子进行毒性鉴定、自激活鉴定以及3-AT抑制浓度鉴定。结果显示，2种转化子均生长正常，说明所构建的2个重组质粒表达蛋白对酵母无毒性作用，其在特异营养缺陷培养基(SC-Leu-Trp-Ura)中无法生长，不能产生自激活现象，3-AT抑制浓度分别为50、75 mmol/L。以上结果说明所构建的2种诱饵质粒均可用于后续酵母双杂工作，为BSV与宿主的蛋白互作奠定了基础。     

MADS-box基因酵母双杂交系统的构建及鉴定

为研究香蕉中MADS-box基因相互作用的分子机理,筛选该基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白,分别构建诱饵质粒载体和香蕉果实采后2 d的cDNA文库,采用共转化法转入酵母细胞中,经过初步筛选鉴定,证明已成功构建了MADS-box基因的酵母双杂交系统。该结果为发现MADS-box基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础。     

百脉根结瘤因子受体NFR5及其相互作用蛋白的研究

以豆科植物百脉根的mRNA为模板，利用RT-PCR方法，扩增到1.0kb结瘤因子受体5（nod factor receptor NFR5）蛋白激酶结构域的DNA片段（nfr5-pk），并将该片段克隆到酵母双杂交BD载体pGBKT7上。通过酵母双杂交技术，筛选接种根瘤菌的百脉根AD-cDNA酵母双杂交文库，从文库中分离到与nfr5-pk相互作用的221个阳性克隆。从这些阳性克隆酵母中分离AD质粒经反复验证，对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析。通过NCBI数据库比对分析鉴定出小G蛋白Rop6等六个与NFR5-PK相互作用的不同蛋白，为进一步研究NFR5基因的功能和调控机制提供了材料。     

水稻瘤矮病毒 P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12 的酵母双杂交载体的构建及自激活效应检测

将编码水稻瘤矮病毒P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的S3,S7,S8,S9,S10,S11和S12基因分别克隆到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中,转化AH109酵母细胞,结果显示:除pGBK-S10转化子可以在SD/-Trp和SD/-His营养缺陷固体培养基上正常生长外,其它转化子均只能在SD/-Trp或SD/-Leu营养缺陷固体培养基上正常生长.通过α-半乳糖苷酶活性分析揭示,除pGBK-S10可以在SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长并变蓝外,其它均不变蓝.结果证实:RGDV Pn10在酵母细胞中具有转录激活活性,融合GAL4的RGDV Pn10蛋白可以在酵母细胞内激活HIS3和MEL1报告基因的表达.暗示该蛋白可能在病毒的侵染和复制过程中参与调控病毒或寄主基因的转录表达.     

大豆酵母杂交cDNA文库的构建及GmSPX3互作蛋白的筛选

为研究Gm SPX3在大豆低磷胁迫响应中的作用机制,寻找与Gm SPX3发生相互作用的蛋白质,利用Gateway技术构建了低磷大豆根系酵母杂交c DNA文库,并使用p GBKT7-Gm SPX3融合蛋白为诱饵,采用酵母双杂交方法筛选酵母杂交c DNA文库,经过显色反应验证后获得21个阳性克隆,通过生物信息学分析,选择2个转录因子编码基因Gm UNE12和Gm Pos F21作为候选基因进行克隆,并分别构建AD载体p GADT7-Gm UNE12和p GADT7-Gm Pos F21,与诱饵p GBKT7-Gm SPX3进行一对一互作验证,结果证明Gm UNE12和Gm Pos F21蛋白均与Gm SPX3诱饵蛋白发生了相互作用。     

甘蓝型油菜热激蛋白Bnp23相互作用蛋白的筛选和鉴定

以甘蓝型油菜热激蛋白p23（Brassica napus hsp23, Bnp23）为诱饵蛋白,用酵母双杂交LexA系统筛选拟南芥幼苗的AD-cDNA（activator domain-cDNA）文库,分离了39个酵母双杂交阳性克隆,其中两个阳性克隆的cDNA片段均编码拟南芥黑芥子酶结合蛋白（Arabidopsis thaliana PYK10 结合蛋白1,AtPBP1）。Blastp搜索到油菜黑芥子酶结合蛋白BnMBP6与拟南芥PBP1同源。经体外实验进一步证实AtPBP1和Bnp23之间存在相互作用。酵母双杂交实验也证实Bnp23能够与BnMBP6相互作用。