兽用疫苗支原体污染的PCR检测技术的建立及应用

根据支原体的16 S rRNA基因设计特异性引物,以兽用疫苗中常见的支原体DNA为模板进行PCR试验,优化反应体系,建立了兽用疫苗支原体污染的PCR 检测方法,并对市场上的兽用疫苗随机抽查检测,其检出率为24.4%(22/90)。结果表明该方法特异性强,灵敏度高,有望成为兽用疫苗支原体污染的检测方法之一。     

用套式PCR检测空气样品中的猪肺炎霉形体

用套式PCR在试验和野外条件下首次成功检测出空气传播的猪肺炎霉形体.空气是用安装在空气过滤器上的polyethersulfone膜(气孔大小为0.2μm)取样.过滤器经过溶解和直接提取DNA两步处理而用于PCR分析.在套式PCR反应中,两对寡核苷酸引物是根据猪肺炎霉形体特有的一段重复序列设计的.在试验中,从8个有呼吸问题的猪舍中采集样品而用于套式PCR分析.结果发现,套式PCR具有极高的特异性和灵敏度,其灵敏度相当于一般PCR的104倍.在野外条件下,若猪场中存在急性呼吸道疾病,则80%的猪场完全可用该方法检测到猪肺炎霉形体.若被感染猪场中无急性病例,则该方法检测不到空气中的猪肺炎霉形体.如果从猪舍的几个位置和较低湿度的空气中取样,那么检测灵敏度就会提高.     

PCR检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体的研究

根据禽霉形体16S rRNA的基因序列设计，合成了1对引物，用这对引物对鸡霉素形体（Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊霉形体（Mycoplasma synoviae,MS)菌株DNA进行PCR扩增，得到了与预期大小相一致的580bp的PCR产物，而这对引物对其他畜病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性，PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为2pg和3pg，应用已建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品，从人工感染样品中均检测到MG，临床样品的MG阳性检出率为10．25％，高于常规分离培养的阳性检出率。     

鸡胚源疫苗中污染霉形体的对策——Ⅲ.热力清除制苗用鸡蛋中霉形体防止活毒疫苗中霉形体污染在工厂化生产中的应用

在工厂生产条件下,对于准备用于生产鸡新城疫弱毒疫苗的8批鸡蛋次第随机分别取其半数左右先行以45℃经14小时预处理,而后再与另一半未处理的鸡蛋同时入孵,接种病毒(LaSota或Ⅱ系)和制造疫苗,共计处理鸡蛋3936枚,未处理对照组4549枚,结果证明,处理组与未处理的对照组的受精蛋制苗利用率平均值分别为84.25%和83.62%,预处理未降低鸡蛋的利用率。制成的疫苗对鸡胚半数感染量平均值分别为8.27和8.22,达到疫苗规定效力要求,预处理不影响疫苗的效力。八批疫苗中除一批因意外事故未完成霉形体检查外,7批处理组的疫苗皆未检出霉形体,而对照组7批中有5批检出了霉形体。说明预处理已消灭了鸡蛋中污染的霉形体。这种方法可以用于疫苗工厂制造无霉形体污染的疫苗。     

绵羊肺炎霉形体疫苗制备及免疫效果检测

绵羊肺炎霉形体可引起羊只发生慢性呼吸道疾病,采用改进Hartley氏消化汤培养基对其进行繁殖培养,收集生长滴度达10^-9以上的培养物,灭活浓缩后制成氢氧化铝疫苗,对羊进行免疫接种,免疫持续到第60、120、180、270天时分别检测其血清IHA效价。第270天以前的阳性率都不低于80％,经宁夏17个规模化羊场及一些养殖户近两年来试用4．75万头份证明,注苗后羊群无不良反应,效果良好。     

鸡胚制活病毒疫苗中霉形体污染的研究

对32个鸡胚,80组(每20个鸡胚液混合物为一组)未加抗生素的新城疫疫苗半成品和14批成品疫苗(其中冻干苗12批和液体苗2批)的样品进行了霉形体污染的检查。结果从一个接种了新城疫病毒 LaSota 弱毒株的鸡胚中,9批半成品疫苗中和10批成品疫苗的样品中分离出了霉形体。共20个分离物,对其中12个进行了种属鉴定,12个分离物中有4个含有两种霉形体,因此共含有16株霉形体,即鸡毒霉形体8株,滑液霉形体7株和一株不属于这两种的霉形体。随机选出3个分离物进行了链霉素敏感性测定。测定结果表明这些菌株的抗药性大为增强,链霉素的最小抑制量为对照株的几十百倍,因而能抵抗疫苗中链霉素的作用而污染了疫苗。建议在产品检验中增加霉形体检测项目。在未能使用 SPF 鸡胚生产疫苗以前应尽速进行消灭污染的研究。     

丝状霉形体山羊亚种巢式PCR检测方法的建立

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列，设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR，建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp．capri，Mmc）的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示，该方法只能对Mmc扩增出195bp的片段，而对其他病原菌不能扩增出任何条带，它最低能够检测出10Pg的Mmc DNA，说明该方法具有良好的特异性和很高的敏感性。田间试验结果显示，对4株霉形体分离株及其病料均可扩增出Mmc特异性片段，表明，该巢式PCR方法可用于Mmc快速鉴定和流行病学调查。     

李斯特菌套式PCR快速检测方法的建立及初步应用

根据GenBank数据库的单核细胞增生李斯特菌iap基因设计2对引物,建立了套式PCR快速检测单增李斯特菌的方法。两对引物分别扩增出约1 500 bp和500 bp片段,与预期大小一致。套式PCR方法灵敏性实验检测极限为10 cfu/mL;人工污染猪肉检测极限为103cfu/mL;整个检测过程可在7 h内完成。采用该法对南海口岸进口的冻肉进行检测,检测出9份阳性,与传统的细菌分离方法完全一致,说明套式PCR方法具有很好的特异性。     

牛瑟氏泰勒虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33基因序列设计2对特异性引物,建立套式PCR检测方法。该方法与弓形虫RH株、猪附红细胞体和犬新孢子虫均无交叉反应,能检测到的最低DNA量为15 fg。在75份临床样本检测中,62份为阳性,阳性率为82.7%。由此可见所建立的套式PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于牛瑟氏泰勒虫急性感染和隐性感染的早期诊断,为该病的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供了新的技术手段。     

用套式PCR方法对几种猪用冻干疫苗的PCV2检测

参照Genbank已发表的猪圆环病毒2型的基因序列,取其比较保守的基因片段ORF2,利用引物设计软件Oli-go5.0设计两对PCV2型特异的引物,其中第一对引物扩增跨度为ORF2全基因片段,长度为702 bp,第二对引物扩增ORF2中间的一个小片段,跨度大小为494 bp.首先用第一对引物扩增阳性DNA,阳性DNA的浓度从10-1稀释到10-11,然后以第一次PCR产物为模板,用第二对引物进行PCR,发现这种套式PCR的方法比用普通PCR灵敏度提高102倍.同这种套式PCR方法对广东省市场上出售的几种猪用弱毒疫苗进行猪圆环病毒2型检测,结果发现这几种疫苗全部为阴性,本实验说明目前广东市场上出售的弱毒疫苗在制作过程中没有受到PCV2的污染,解除了广大猪场主的顾虑.     

牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

巢式PCR检测猪鼻支原体方法的建立及应用

应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasmah yorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法.在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体;敏感性试验表明,第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L.对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3％(12/41)和82.9％(34/41).结果表明,巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术.     

牛结核病巢式PCR快速检测方法的建立

根据分枝杆菌（mycobacteria）保守的插入序列IS1081设计4条特异性引物，建立了快速检测牛结核病的巢式PCR方法。该方法一次扩增的敏感性是1．35pg，二次扩增的敏感性是1．35fg。在对95份PPD阳性牛临床病料组织和23份血液样本的PCR检测中，用引物TB—Q1和TB-Q2做一次扩增，阳性检出率分别为36／95（37．5％）和5／23（21．7％）；用引物TB—B1和TB—B2做二次扩增，阳性检出率分别为81／95（85．3％）和14／23（60．9％）。该方法作为辅助PPD试验的快速检测方法用于牛结核病的流行病学调查，具有重要的实用价值和应用前景。     

猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式PCR方法明显优于血涂片染色镜检法及常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。     

A simplified PCR assay for fast and easy mycoplasma mastitis screening in dairy cattle

A simplified polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for fast and easy screening of mycoplasma mastitis in dairy cattle. Species of major mycoplasma strains [Mycoplasma (M.) bovis, M. arginini, M. bovigenitalium, M. californicum, M. bovirhinis, M. alkalescens and M. canadense] in cultured milk samples were detected by this simplified PCR-based method as well as a standard PCR technique. The minimum concentration limit for detecting mycoplasma by the simplified PCR was estimated to be about 2.5 × 10³ cfu/mL and was similar to that of the standard PCR. We compared the specificity and sensitivity of the simplified PCR to those of a culture method. Out of 1,685 milk samples cultured in mycoplasma broth, the simplified PCR detected Mycoplasma DNA in 152 that were also positive according to the culture assay. The sensitivity and specificity of the simplified PCR were 98.7% and 99.7%, respectively, for detecting mycoplasma in those cultures. The results obtained by the simplified PCR were consistent with ones from standard PCR. This newly developed simplified PCR, which does not require DNA purification, can analyze about 300 cultured samples within 3 h. The results from our study suggest that the simplified PCR can be used for mycoplasma mastitis screening in large-scale dairy farms.     

马泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫PCR检测方法，用Bec-UF2、Equi-R；EMA-1F、EMA-1R两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的核蛋白体基因和表面蛋白基因进行了常规PCR方法检测，用EMA-5、EMA-6；EMA-7、EMA-8两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的表面蛋白基因进行了PCR和套式PCR方法检测。结果显示，以Bec-UF2、Equi-R为引物的PCR方法的阳性检出率为57．1％（32／56），以EMA-5、EMA-6；EMA-7、EMA-8为引物的套式PCR方法的阳性检出率为51．8％（29／56），以EMA-1F、EMA-1R为引物的PCR方法的阳性检出率为17．9％（10／56）。结果表明，以Bec-UF2、Equi-R为引物的常规PCR方法为检测马泰勒虫的最佳方法。     

猪附红细胞体PCR与光镜检测方法的比较研究

应用鲜血压片、姬姆萨染色、吖啶橙染色三种光镜检测方法以及PCR法检测猪附红细胞体,对临床20例疑似病例进行检测,比较其检出率,结果表明,鲜血压片、姬姆萨染色、吖啶橙染色以及PCR法临床检测率分别为20%、35%、50%、70%。证实PCR检测方法明显优于其它光镜检测方法。