拟松材线虫对黑松致病性研究

松材线虫病（Ｂｕｒａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）是发生在松树上的一种毁灭性病害 ,目前已在日本、中国、美国、加拿大和韩国等分布 ,并在日本和中国造成巨大的损失。在北美洲 ,松材线虫分布也很广。针叶树中还有一些形态与松材线虫非常相近的伞滑刃线虫 ,统称松材线虫复合种（ＰＷＮＣ） ,其中最常见的是拟松材线虫。拟松材线虫在东亚、美洲、欧洲都有 ,分布极广泛。杂交试验和ＤＮＡ分析证实松材线虫和拟松材线虫有密切的关系 ,能用ＲＡＰＤ和ＲＦＬＰ技术进行区分 ,拟松材线虫的ＤＮＡ有东亚和欧洲两种类型 ,前者主要分…     

拟松材线虫对黑松苗的致病性

测定来源于中国、日本、韩国、加拿大、挪威和法国的20个拟松材线虫种群对2年生黑松苗的致病力。根据其致病力大小分为3类：第1类致病力很强，致死率大于85％，RHS(相关寄主适生性)系数大于100，包括法国的1个种群和中国的3个种群；第Ⅱ类有较强的致病潜能，在环境适宜的情况下可能造成严重危害，这一类数量最多，包括中国的11个种群和加拿大的1个种群；第Ⅲ类几乎没有致病力，其致死率和RHS系数都是0，包括韩国的2个种群及日本和挪威各1个种群。试验证明法国BmFr种群致死速度最快，致病力最强。黑松苗在感染拟松材线虫后，用自然界水分胁迫和PEG胁迫处理，结果表明，干旱胁迫能明显加快黑松苗死亡速度，且大大提高死亡率。提示在高温干旱的年份拟松材线虫可造成松树的大面积死亡。     

不同松材线虫群体对黑松的致病性测定

测定了中国、日本、加拿大的松材线虫（Bursaphelenchus xylophius)群体3－4年生黑松的致病性，发现它们的致病力有明显分化。松材线虫不同群体致黑松的死亡率为0－87．5％，RHS系数为0－110不等。中国松材线虫群体致病力高于日本和加拿大群体，其中以中国的BxCN1,BxCN3,BxCSC和BxCZD4个群体致病力最强，致枯率均为87．5％，RHS系数均大于90。在致枯率为87．5％的6个群体中，南京的群体BxCN3平均死亡天数量短（38d)。在全部测试群体中，Bx-CZD的死亡历期最短（14d)。试验发现接种松材线虫的松苗有带虫不表现症状的现象，这对于病害的传播非常重要。     

接种松材线虫后黑松接种枝内细菌和线虫的数量变化

对接种松材线虫Bursaphelenchus xylophilus后3年生黑松Pinus thunbergii接种枝内的细菌和线虫的数量变化进行了观察.结果表明:接种后最初几天内线虫从接种点向其他部分移动缓慢;至接种的主干上松脂减少时,线虫开始增加,木块组织的带菌率的变化与线虫数量的变化趋势相似,细菌和线虫的数量与病树的症状发展密切相关.细菌的优势属为假单胞杆菌属Pseudomanas.表3参9     

松材线虫携带细菌在疫区和寄主中的分布及致病性研究

作者在江苏、上海、广东、安徽、湖北、浙江等疫区 ,采集了呈现松材线虫病典型症状的黑松、马尾松的病样 ,采用病木组织分离法 ,分离获得松材线虫所携带的细菌菌株 2 4株 ,经鉴定 ,2 4株细菌中 ,假单胞菌属有 11株 ,泛菌属有 6株 ,其余有不解糖消化链球菌、河生肠杆菌、乡间步丘菌和粘质沙雷菌 .由此可知 ,假单胞菌和泛菌分布较广 ,在所有采样疫区感染松材线虫病的马尾松和黑松病死木中都能分离到 ,是普遍存在病木组织中松材线虫携带的主要细菌 .致萎活性测定结果表明 :所有假单胞菌属和泛菌属的菌株对无菌黑松切根苗均有致萎活性 .用假单胞菌和泛菌分别与无菌松材线虫混合接种室内无菌黑松苗和野外多年生黑松 ,结果表明 :用细菌单独接种 ,无菌黑松苗和野外黑松均不发病 ,无菌松材线虫单独接种的无菌黑松苗和野外黑松也不发病或发病轻、慢 ,无菌线虫和致萎细菌二者混合接种能使无菌黑松苗和野外黑松发病快且严重 .由此认为松材线虫携带到寄主组织中的假单胞菌和泛菌属的一些种对松材线虫病有明显的协同作用     

松材线虫对黑松叶部游离脯氨酸含量的影响

植物在受到不同环境胁迫时,体内的游离脯氨酸含量会发生很大的变化.国内外对植物受水分胁迫时体内游离脯氨酸累积的研究较多,而对植物在受病原物感染后游离脯氨酸累积的研究相对较少,对植株脯氨酸含量与抗病性的关系更少见报道.本文研究了松材线虫侵染后,松树体内游离脯氨酸如何变化,以及与松树感病性是否存在一定关系,为研究松材线虫病致病机理和松树的抗性鉴定等提供新途径.1　材料与方法　　供试松树为8～9ａ生黑松(ＰｉｎｕｓｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉＰａｒｌ.).松材线虫分离自安徽省宁国市的马尾松,采用常规单异活体培养技术,在灰葡萄孢(…     

接种不同浓度松材线虫的黑松光谱学特征分析

利用光谱学进行植物病害的早期诊断是近年来植物病害监测预警研究的一个热点。本试验采用人工接种不同浓度松材线虫的方法,研究了野外健康黑松不同发病阶段黑松松针的反射光谱特征曲线,分析了多个光谱特征参数。结果表明:绿光波段(500～560 nm)和近红外波段(750～900 nm)反射光谱曲线对松树发病程度有一定的指示作用;红边(680～780 nm)位置蓝移、绿峰(510～580 nm)反射高度及红谷(640～700 nm)吸收深度降低、红边斜率减小等光谱特征参数的变化能够很好地反映松树的感病情况。本研究结果可为利用高光谱遥感技术进行松材线虫病监测与预警提供理论依据。     

松材线虫产生的分泌物对松树的致病作用

用多毛孢(Pestalotia sp.)培养松材线虫,经过表面消毒后,在Tris-HCl缓冲液中振荡培养,培养液经硫酸铵沉淀、透析、冷冻真空干燥,制成的干样,用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。松材线虫能向体外分泌多种可溶性蛋白,发现有纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶。用松材线虫产生的分泌物、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶接种3年生黑松(Pinus thunbergii),发现松材线虫产生的分泌物和纤维素酶能够导致松针枯死。这暗示松材线虫的分泌物可能是松材线虫病因之一。     

黑松感染松材线虫后细胞结构变化及PCD

电镜观察到两年生黑松感染松材线虫后,茎中形成层细胞以及其他的薄壁细胞出现细胞程序性死亡PCD特征:细胞核变形、核染色质浓缩并边缘化;细胞质和液泡中出现大量环状片层及多泡体;细胞壁出现膨胀扭曲;线粒体峭数目减少直至双层膜破毁.在整个变化过程中,细胞质膜始终是完整的,内质网在细胞器降解过程中扮演了重要角色,细胞核在线粒体等细胞器降解之后才崩塌消失.这表明,黑松感染松材线虫后的系统反应过程中有PCD发生,其变化类似于动物细胞中的细胞死亡.黑松感染松材线虫后的系统反应过程中,PCD是持续发生的,最终引起植株全面崩溃,这可能是感病黑松死亡的内因.在感病10d后,形成层区才开始出现空洞化现象.因此,形成层的空洞化并非是植株死亡的主因,而是其感病症状.     

不同松材线虫虫株致病性的比较分析

松材线虫萎蔫病是由松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus（Steiner＆Buhoror）Niclde]引起的松属树种上一种毁灭性的病害,目前对该病的致病机理尚不十分清楚。本研究采用松材线虫的6个虫株和拟松材线虫的1个虫株对1年生黑松苗进行致病性测定。结果表明,1、6号虫株致病性较强;2、5号虫株致病性较弱;3号和4号致病性居中。6个虫株的松材线虫最终都能导致黑松死亡,拟松材线虫不具有致病性。     

中国与美国松材线虫体表细菌在线虫体表对峙及对松苗致病性

松材线虫体表的细菌存在演替现象,美国松萎蔫病危害不严重的原因可能是松材线虫体表细菌演替的结果。利用美国线虫体表的细菌来替代中国线虫体表的细菌,从而降低中国松萎蔫病的流行,为松萎蔫病的生物防治提供了可能。为此,本研究从3株美国松材线虫体表分离得到15株细菌菌株,并确定MG3、MG4、MG5、MG8、MG9、MG11、MG12为优势菌株。用中国松材线虫体表的4个致病细菌菌株YG1、YG2、YG3、YG4分别和15株美国菌株在实验室条件下进行对峙,发现美国MG4、MG5、MG8、MG9等菌株在松材线虫体表具有很强的竞争能力。用竞争能力最强的3个美国菌株MG5、MG8、MG9,混同无菌松材线虫分别对黑松、马尾松、湿地松和油松进行接种,发现相对于中国YG2菌株,美国菌株MG8和MG9对4种松树的致病性均明显较低。提出美国菌株MG8和MG9可以作为生物防治的候选菌株。      

美国松材线虫体表携带优势细菌的鉴定及致病性

为证实松材线虫Bursaphelenchus xylophilus虫株携带弱毒细菌替代强毒株系防治松树萎蔫病这一思路的可行性,从2个美国松材线虫虫株体表分离并确定了优势细菌,测定了各优势细菌的毒性和致病性．并对这些菌株进行了初步鉴定。细菌分离结果显示：MG4,MG5,MG8和MG9等4菌株为美国线虫体表的优势菌株。毒力测试表明．与中国松材线虫携带的强致病菌相比,美国松材线虫携带的4个菌株的产毒能力和致病性均较低．可以作为生防细菌的候选菌株使用。经细菌的常规染色、形态学观察及16SrDNA序列分析,MG4,MG5,MG8和MG9菌株分别被鉴定为代夫特茵Deftia tsuruhatensis,恶臭假单胞茵Pseudoinonas putida,嗜麦芽窄食单胞茵Stenotrophomonas maltophilia和泛菌属1种Pantoea sp．。图2表3参20     

细菌对松材线虫繁殖的影响

该研究采用从中国松材线虫病发生的6个疫区、2种主要寄主马尾松和黑松的不同发病期采集病木,从病木上直接分离并鉴定了松材线虫携带的18株属于假单胞属、泛菌属以及其他属的细菌菌株.用双氧水处理松材线虫卵得到无菌卵,在无菌条件下,研究松材线虫携带的细菌对其繁殖的影响.结果表明只有假单胞菌属的细菌菌株能够显著促进松材线虫的繁殖,其他细菌菌株均抑制松材线虫的繁殖.该试验证明了假单胞菌属的细菌在松材线虫病发病过程中起重要的作用,这一发现为松材线虫病的线虫与细菌复合致病假说提供了进一步的实验证据.      

松材线虫携带的一株细菌分离及其致病性

从患松材线虫病致死的黑松和马尾松病树组织及松褐天牛虫体中分离的松材线虫虫体上均分离到同一细菌菌株 .经致病性、革兰氏染色、菌体形态、培养性状和生理生化反应等测定 ,将致病菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌 .ATBExpression自动鉴定仪的鉴定结果与上述结果相同 .在分离过程中该菌出现频率较高 ,说明是松材线虫携带的主要细菌 .人工接种试验结果显示 ,用无菌线虫或洋葱伯克霍尔德氏菌菌株分别接种的黑松无菌苗不发病 ,而用二者混合接种则使无菌苗迅速发生褐变和萎蔫 .林间利用 6年生黑松进行的接种试验结果证明 ,用无菌松材线虫和洋葱伯克霍尔德氏菌菌株混合接种的黑松与使用野生松材线虫接种的黑松都 10 0 %的患病 .单独用无菌松材线虫接种有 4株发病 ,6株没有发病 .其中发病黑松中不仅分离到了松材线虫 ,也分离到了细菌 ,而没有患病的 6株黑松中仅分离到少量松材线虫 .这说明在野外条件下接种的松材线虫可以通过某种途径重新获得细菌 ,导致了接种的黑松患病 .而接种后无菌松材线虫没能获得细菌的那些黑松就没有患病 ,说明单独无菌松材线虫不能使黑松患病 .这些结果说明松材线虫携带的细菌与松材线虫的致病性有关 .因此 ,可以把松材线虫病看作是线虫和细菌共同侵染引起的一种植物复合侵染病害 .在这     

荧光假单孢细菌培养的无细胞滤液导致松萎蔫的病状观察

将松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌混合物、致病细菌鞭毛蛋白无细胞滤液、无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌混合物接种黑松导致的松树萎蔫的病状与野生松材线虫导致松树萎蔫的病状进行观察和对比,结果为:(1)经培养的致病荧光假单孢菌GcM5-1A菌株的无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物接种导致的黑松的病状变化趋势与松材线虫致死的黑松病状是一致的;无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌AM2C混合物不能使黑松发病;(2)致病细菌GcM5-1A无细胞滤液和野生松材线虫导致的黑松病状和病程天数无显著差异;(3)接种无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物的黑松病程显著长于接种野生松材线虫的黑松.结果可以用松萎蔫病是松材线虫和其携带的细菌的复合侵染病害的假说和松材线虫与其携带的细菌之间的互惠共生关系的论点来解释,说明松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液是松萎蔫病致病的真正原因.     

环氧乙烷对松木片中松材线虫的熏蒸效果

在18℃、60%-70%RH的室内条件下,研究了不同剂量环氧乙烷(EO)对松木片中松材线虫的熏蒸效果.结果表明:EO对松材线虫具有一定的熏杀作用,松材线虫的死亡率(y)与EO剂量(x)呈线性相关[y=-44.998+1.838x(p=0.00948)],EO对松材线虫的LD50为51.686 g.m-3,LD99.9为78.835 g.m-3;松木片对EO的吸附作用很大,当EO剂量为56 g.m-3时,24 h浓度值为1.157 g.m-3,吸附量达到89.974 mg.L-1,且吸附量随剂量的增大而增加,吸附主要发生在熏蒸开始后4 h内,4 h吸附率可达94%以上.因此,不推荐将EO用于集装箱内松木片松材线虫的处理.