贺兰山东麓不同酿酒葡萄品种成熟期白藜芦醇含量的差异

以不同酿酒葡萄品种"霞多丽""贵人香""烟73""西拉""梅鹿辄""赤霞珠""品丽珠""蛇龙珠"和感染卷叶病毒的"蛇龙珠"等为试材,系统研究了不同成熟期葡萄果实中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及白藜芦醇(resveratrol,Res)含量,以了解贺兰山东麓不同酿酒葡萄品种成熟期Res含量的差异。结果表明:宁夏贺兰山东麓不同酿酒葡萄品种Res含量差异较大。白色品种中未检测到PAL,有色品种中PAL活性次序为"赤霞珠""梅鹿辄""品丽珠""烟73""西拉";Res含量最高的是"烟73",其次是"西拉""梅鹿辄""赤霞珠""品丽珠""贵人香""霞多丽";感染卷叶病毒的"蛇龙珠"的PAL活性和Res含量均高于健康植株。     

黄芪鲨烯合酶基因的克隆和序列分析

参照豆科其他植物的鲨烯合酶基因序列设计了引物,通过逆转录PCR方法,从荚膜黄芪(Astragalus membranaceus (fish.) Bge)中克隆了鲨烯合酶基因cDNA序列(GenBank登录号HQ829974).通过BLAST发现黄芪鲨烯合酶推测的氨基酸序列与大豆鲨烯合酶( BAA22559.1)序列相似...     

桃果实ACC合酶cDNA的克隆

根据其它植物ＡＣＣ合酶氨基酸保守区设计两组简并引物,用套式ＰＣＲ技术从桃成熟果实ｃＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ大小特异性片段,将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,对重组克隆ｐＰＡＣＳＩ进行全序列测定表明,插入片段全长１１００个碱基,编码３６６个氨基酸,该基因与番茄、笋瓜、小西葫芦、康乃馨、苹果ＡＣＣ合酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为７２．７％,７１．３％,７１．１％,６９．１％,６５．４％。ＲＮＡ点杂交表明ｐＰＡＣＳＩ基因随着桃果实成熟表达活性增强,乙烯处理能诱导桃果实该基因的表达。     

柿法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与序列分析

在萜类生物合成途径中起重要作用的关键酶—法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl Diphos-phate Synthase,FPS),对植物的生长发育、抗逆性以及次生代谢都起着重要的调节作用。通过cDNA末端快速克隆的技术(Rapid-amplification of cDNA Ends,RACE)从柿果实中克隆到法呢基焦磷酸合酶基因cDNA片段,并进行了序列的相关分析。结果表明:所克隆的FPS基因和NCBI数据库中已登录的云杉、腊梅、百合等植物FPS基因核苷酸序列的同源性分别达到88%、75%、73%,并且与香蕉、水稻、橄榄等植物FPS基因氨基酸序列的同源性分别达到72%、67%、66%。该基因已提交GenBank数据库,登录号为JN108022。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤–2’白藜芦醇含量高,并抗白粉病。以此为材料,利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因VqSTS12和VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化,分别获得7个VqSTS12和5个VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量PCR分析发现,与野生型植株相比,转基因植株中芪合酶基因STS与下游白藜芦醇糖基转移酶基因RSGT表达量升高,与STS有底物竞争关系的查尔酮合酶基因CHS表达量降低。STS的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现,转基因植株对白粉菌的敏感性降低,发病较晚,病情较轻,在转基因植株上部分孢子萌发受抑制,菌丝发育迟缓。转基因植株中VqSTS12和VqSTS25受白粉菌诱导表达:在接菌后1～3 d内表达量显著升高,随后略有下降,在6～7 d表达量再次上升。同时高效液相色谱(HPLC)检测到STS的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄VqSTS12和VqSTS25及其表...     

葡萄不同品种和组织白藜芦醇含量的差异

用ＨＰＬＣ法测定葡萄果肉,叶柄,种籽,叶片,果皮及果穗轴中白藜芦醇的含量,发现葡萄品种间各组织白藜芦醇含量的差异较大,葡萄果穗轴和果皮中的含量较高。提出了优选品种制作高白藜芦醇含量的葡萄酒及综合利用葡萄皮渣提取白藜芦醇的建议。     

刺葡萄果实及酿酒过程中白藜芦醇含量变化研究

以湖南省内不同类型刺葡萄为试材,以酿酒葡萄品种‘赤霞珠’为对照,采用高效液相色谱法检测刺葡萄果实不同部位白藜芦醇含量,同时选用干红葡萄酒酿酒工艺进行酿造,研究刺葡萄果实及果实在酿造过程中白藜芦醇含量的动态变化规律。结果表明:大部分类型刺葡萄果皮中均检测到白藜芦醇,澧县-1刺葡萄和中方-2刺葡萄果皮含量最高,均为34.08μg/g,是‘赤霞珠’的1.70倍;长沙-2刺葡萄籽中白藜芦醇含量为28.36μg/g,是‘赤霞珠’籽的3.83倍,其他类型刺葡萄籽和所有类型刺葡萄果肉中均未检测到白藜芦醇。酿酒过程中添加F15酵母的葡萄酒中白藜芦醇含量始终高于添加VL1酵母的葡萄酒,陈酿结束后,芷江-1刺葡萄酒白藜芦醇含量最高,为0.17μg/mL,比‘赤霞珠’葡萄酒高21.4%。     

葡萄无核基因SCAR标记的序列构成与酶切分析

利用葡萄无核基因的特异探针１８ｂｐ,通过ＰＣＲ扩增获得了与葡萄无核基因相连锁的ＳＣＡＲ标记约５９０ｂｐ,采用自动荧光ＤＮＡ测序仪对该片段的核苷酸组成进行双向测序,来自无核白的无核基因特异标记由５６９对核苷酸组成。该标记可以作为合成探针和设计特异引物进行ＰＣＲ扩增的基础,用于检测葡萄育种材料和无核品种的无核性。     

无核白葡萄脱水素等位基因的克隆及序列分析

以欧洲葡萄无核白品种(Vitis vinifera cv.Thompson Seedless)为研究材料,根据霞多丽品种脱水素基因序列设计引物并PCR扩增。PCR产物用地高辛标记并Southern杂交分析,发现无核白基因组含有2个不同的脱水素基因。设计并采用一种基于对琼脂糖凝胶梯状切割回收的方法克隆这2个不同脱水素基因的DNA片段,分别命名为DHN1-L和DHN1-S。进一步用反向PCR法获得这2个脱水素基因DNA片段的侧翼序列,获得基因DNA全长序列(NCBI登录号分别为EF371882和EF371881)。与已公布葡萄基因组序列比对,这2个基因位于第4号染色体相同位置,为等位基因,说明无核白品种脱水素基因为杂合体。2个脱水素基因所翻译蛋白在疏水性及三级结构方面有差异。无核白葡萄脱水素基因等位基因DNA序列的获得为进一步分析等位基因变异对植物抗逆性的影响提供了依据。     

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因的克隆及序列分析

番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物,可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000—2001年,我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明,Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79%～84%,氨基酸序列同源性为89%～94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。     

桂花SVP同源基因的克隆及序列分析

试验以桂花‘日香桂'Osmanthus fragrans cv.rixianggui嫩叶为试验材料,根据转录组数据库中SVP基因的保守序列信息,通过PCR方法克隆得到日香桂SVP基因,将其命名为QfSVP,运用在线生物信息学分析工具对OfSVP序列进行分析。结果表明:OfSVP基因全长1325bp,开放阅读框(ORF)为687bp,编码228个氨基酸。氨基酸序列保守性分析发现,OfSVP所编码的蛋白中含有MADS-box基因家族特有的K-box区域。通过ProtParam ExPASy在线软件分析OfSVP蛋白质分子式为C1121H1859N327O364S9,分子量为26030.60Da,理论等电点PI值为5.80。不稳定指数为68.10,属于不稳定蛋白质。蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明OfSVP与油橄榄(Olea europaea)、黄连(Coptis chinensis)和芝麻(Sesamum indicum)的同源性分别达到94%、83%和82%;OfSVP基因的克隆与序列分析对于进一步了解桂花'日香桂'成花机理具有重要意义。     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

观赏桃查尔酮合成酶基因的克隆及其序列分析

 以观赏桃品种‘红雨垂枝’为试材,采用SON-PCR方法从叶片中快速获得了查尔酮合成酶基因全长序列,命名为PphCHS,GenBank登录号为JN391444,其长度为2353 bp,具有一个1140 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码379个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,PphCHS与已报道的其他植物的CHS推导的氨基酸序列具有高达90%以上的相似性;氨基酸聚类分析表明：观赏桃首先与樱桃李聚类,其次与草莓。生物信息学分析表明：PphCHS蛋白含有查尔酮合酶家族的特征多肽序列RLMMYQQG CFAGGTVLR,不含信号肽序列。     

斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆与序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是糖酵解和卡尔文循环中的关键酶,本实验室之前的研究发现斑玉蕈菌丝的GAPDH表达随培养基中葡萄糖添加浓度的变化而变化,在此基础上我们首次克隆了斑玉蕈GAPDH的DNA和cDNA序列,结果斑玉蕈gpd基因长2 724 bp,对比基因组DNA和cDNA序列知其中有7个内含子、8个外显子;其理论分子量为36.15 kD、编码蛋白质含338个氨基酸、等电点(PI)为8.24。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

葡萄离体叶片和果实白藜芦醇及其糖苷合成对UV-C辐射诱导的响应

以‘北丰’和‘北全’葡萄离体叶片和果实为试材,研究了葡萄不同器官内白藜芦醇（Res）及其糖苷合成对紫外线C（UV-C）辐射诱导的响应,结果表明：不同器官反式白藜芦醇（trans-Res）合成积累对UV-C辐射诱导反应存在差异。叶片适宜的UV-C辐射剂量为1.8 kJ · m-2,而果皮为1.8 ~ 5.4 kJ · m-2,果实Res合成积累对UV-C辐射诱导的敏感性低于叶片。3.6 kJ · m-2 UV-C辐射果粒对种子中trans-Res含量没有显著影响,直接辐射完整种子或剖开种子切面也不能显著提高trans-Res含量。UV-C辐射处理的叶片和果皮中trans-Res含量随辐射后常温避光孵育时间的延迟表现出先升后降的趋势,而反式白藜芦醇苷（trans-PD）和顺式白藜芦醇苷（cis-PD）含量在12 ~ 48 h内迅速提高,之后维持在相对稳定状态。种子中trans-Res含量在整个孵育过程中与对照之间均不存在显著差异。     

杧果MADS-box基因保守区片段的克隆与序列分析

为从杧果中克隆新的MADS-box基因,利用MADS-box转录因子的保守特征设计简并引物,应用RT-PCR从杧果花序中成功分离出14条MADS-box基因cDNA片段。片段长度在138~147bp之间,推导的氨基酸序列与已知的杧果MADS-box基因的同源性为65.2%~82.6%。用推导的氨基酸序列与已知的杧果和拟南芥MADS-box基因进行系统发育分析,可将这些片段归入MADS-box的不同亚家族中。表明杧果花序中存在多种MADS-box转录因子,参与杧果花器官的发育及开花时间的调节。     

茉莉花萜类合成酶基因JsTPS的克隆及其表达分析

以双瓣茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,克隆了萜类合成酶基因（JsTPS）的全长cDNA,该cDNA全长为1 884 bp,其中ORF为1 491 bp,编码496个氨基酸的蛋白,分子量56 989.7 D,与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与油橄榄（Olea europaea）的TPS2具有75%的同源性,同属于α-Farnesene synthase分支。采用荧光定量PCR技术检测JsTPS在茉莉花开放过程中的表达量变化,结果表明,表达量在未开放时（18：00）最低,在半开放时（22：00）达到最高。     

葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的克隆及表达分析

 在前期获得葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的EST基础上,采用RACE和RT-PCR技术克隆该基因cDNA全长序列。VpSTART全长1 321 bp,3′端非编码区114 bp,包含一个1 206 bp开放阅读框,编码401个氨基酸。VpSTART蛋白分子量为45.3 kD,与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖麻的蛋白同源性分别为99%、64%、58%、46%和25%。实时荧光定量PCR表明,VpSTART在‘商–24’葡萄花序、卷须和茎中表达量较高;感白粉病的‘湖南–1’葡萄叶片接种白粉病菌后VpSTART表达量与对照没有显著差异,而抗白粉病的‘商–24’葡萄接种12 h后VpSTART表达量增加,在24 ~ 96 h表现显著性差异;用SA、MeJA和Eth等不同信号分子分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄叶片1 ~ 48 h后,VpSTART基因的表达受SA负调控,受MeJA和Eth正调控。