香石竹尖孢镰刀菌PCR检测

采用多重引物聚合酶链式反应(Multiplex-PCR)技术检测香石竹尖孢镰刀菌纯培养和香石竹样品,并用分离培养技术加以验证.结果表明,PCR能特异地检测出所有16个香石竹尖孢镰刀菌菌株,并证实了昆明地区的香石竹尖孢镰刀菌为2号生理小种.PCR与分离培养技术检测结果基本一致,但总体上PCR检测阳性率稍高于分离培养检测的发病率.PCR能检测出接种7 d后香石竹病原菌,而观察病症需20 d.该项技术具有更高的灵敏度,适用于香石竹种苗的检测和病害流行学研究.     

杨树枯萎病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立荧光定量PCR检测杨树枯萎病的方法和明确前期分离的拮抗菌N6-34对杨树枯萎病致病菌尖孢镰刀菌的作用,本试验采用常规PCR法扩增尖孢镰刀菌的特异性片段,将此片段与载体连接构建质粒,提取质粒DNA在实时荧光定量PCR仪上采用两步法进行扩增并绘制实时荧光定量PCR标准曲线,同时对杨树进行不同灌根处理(T1:1×10~6 cfu/mL的尖孢镰刀菌孢子悬液和未接N6-34菌株的发酵培养液各20 mL;T2:1×10~6 cfu/mL的尖孢镰刀菌孢子悬液和灭活的N6-34菌株发酵培养液各20 mL;T3:1×10~6 cfu/mL的尖孢镰刀菌孢子悬液和N6-34菌株的发酵培养液各20 mL),并于10、20、30 d取样检测杨树根际尖孢镰刀菌数量。结果表明:本研究建立的方法能应用于土传尖孢镰刀菌导致的杨树枯萎病的检测;T1处理的尖孢镰刀菌的数量随处理时间的延长呈先下降后上升的趋势,T2和T3中的尖孢镰刀菌数量则呈下降趋势,表明N6-34能够抑制尖孢镰刀菌。本研究对指导杨树种植和病害预报具有极为重要的应用价值,能够为杨树病害管理提供科学依据。     

应用尖孢镰刀菌培养滤液室内鉴定香石竹品种抗病性初探

采用香石竹尖孢镰刀菌培养滤液,在瓶内对8个香石竹品种的组培苗进行了镰刀菌枯萎病抗性鉴定,结果鉴定出高抗品种1个,中抗品种4个,中感品种2个,高感品种1个;初步建立起香石竹品种对镰刀菌枯萎病抗性的室内鉴定方法。     

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）的生长特性

【研究目的】研究尖孢镰刀菌的生长特性,寻找培养过程的异质性指标。【方法】供试菌株为黄瓜尖孢镰刀菌F-H.6.5-030318-J2和花生尖孢镰刀菌F-P.5.0-030710,培养基采用PSA培养基,装液量为100ml/250ml,接菌量从培养7d的平板上打取3个6mm的菌片,培养温度为25±1℃,摇床转速为110r/min,培养10d,观察测定发酵液颜色、OD值、pH值、菌丝干重变化,并利用聚类分析方法划分生长阶段。【结果】在培养过程中,尖孢镰刀菌发酵液的颜色、OD值、pH值和菌丝干重都会随着培养时间而变化。在相同的培养条件下,来源于不同寄主的尖孢镰刀菌菌株之间在颜色和OD值变化存在着显著性差异,而pH值和菌丝干重变化未表现出显著性差异。来自黄瓜和花生的尖孢镰刀菌菌株的生长分为3个阶段:1￣2d为适应阶段,3￣5d为对数生长阶段,6￣10d为稳定阶段。【结论】尖孢镰刀菌在培养过程的色素变异和OD值的变化可作为菌株培养的表征性特征。     

西瓜种传尖孢镰刀菌致病性及其粗毒素对种子发芽的影响

采用浸胚根法和浸根法对京欣一号西瓜种壳分离得到的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行致病性试验.结果表明:从接种后发病幼苗上分离得到的分离物与最初接种所用的镰刀菌菌落形态和生长速率等性状基本相同,采用相同的引物对rDNA进行PCR扩增获得的核苷酸序列完全相同,说明这二者为同一种菌,从而证明西瓜种子上所携带的尖孢镰刀菌具有致病性,在国内首次报道了西瓜种传尖孢镰刀菌具有致病性.西瓜种传尖孢镰刀菌培养滤液和粗毒素提取物处理西瓜种子后,种子的发芽势、发芽率和发芽指数均显著降低,其中发芽势下降了16.7%～29.0%,发芽率下降了14.4%～22.3%,发芽指数下降了19.1%～37.1%,说明培养滤液和粗毒素提取物可影响西瓜种子发芽.     

尖孢镰刀菌及欧文氏杆菌复合侵染引起的半夏腐烂病研究

以家种健康半夏、发毛半夏和腐烂半夏为材料,对引起半夏腐烂病的尖孢镰刀菌和欧文氏杆菌进行分离、提纯、镜检、回接和药敏试验。结果在家种健康半夏和发毛半夏中分离出尖孢镰刀菌,在发毛半夏和腐烂半夏中分离到欧文氏杆菌。通过对2种菌回接,半夏接种尖孢镰刀菌腐烂病发病率为0,发芽率75%;接种欧文氏杆菌腐烂病发病率为20%,发芽率60%;而先接种尖孢镰刀菌,过3 d后再接种欧文氏杆菌的腐烂病发病率为90%,发芽率20%。药敏试验和盆栽试验发现,尖孢镰刀菌对三唑类农药戊唑醇敏感,欧文氏杆菌对乙蒜素敏感,并具有很好的防治效果。综上,半夏腐烂病是由尖孢镰刀菌和欧文氏杆菌复合侵染引起。     

芝麻枯萎病菌毒素主成分结构与特性分析

芝麻枯萎病是芝麻主要病害之一,由尖孢镰刀菌芝麻专化型侵染引起。为探明芝麻枯萎病菌产毒类型,试验采用高效乙酸乙酯萃取法,对尖孢镰刀菌株HSFO07021菌液进行了粗毒素提取;采用中压制备色谱仪,首次成功分离了尖孢镰刀菌芝麻专化型3种主要毒素。结构鉴定显示,尖孢镰刀菌芝麻专化型的3种毒素分别为镰刀菌酸、9,10-脱氢镰刀菌酸和10-羟基镰刀菌酸。种子处理结果表明,尖孢镰刀菌芝麻专化型产生的镰刀菌酸和9,10-脱氢镰刀菌酸均能抑制芝麻幼苗的茎叶生长和根部伸长,对幼苗产生毒害;镰刀菌酸的毒性强于9,10-脱氢镰刀菌酸。     

新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病病原菌的分离与鉴定

【目的】研究新疆吉木萨尔大蒜种植区大蒜根腐病的病原菌。【方法】采用常规组织分离法分离纯化病原菌,用传统的形态学鉴定方法,结合分子生物学方法对菌株进行鉴定。用原位伤根法进行回接,对照科赫法则明确致病菌的种类及其致病力。【结果】在采集的3批次典型病害植株组织和根际土壤中分离得到64株分离物,其中61株分属于镰刀菌,分属于尖孢镰刀菌、层生镰刀菌、芳香镰刀菌、三线镰刀菌、轮状镰刀菌和木贼镰刀菌。尖孢镰刀菌和层生镰刀菌分离频率累计达到76.6%,且在采集的各个时期都有分离出现。选取典型的5株菌株进行回接测定,回接的5个镰刀菌种均表现出不同程度的致病性,其中尖孢镰刀菌是大蒜根腐病分离频率最高、且致病性最强的致病菌,其次为层生镰刀菌。【结论】新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病是由镰刀菌属的真菌引起的,其中尖孢镰刀菌是致病的优势种。     

镰刀菌对大蒜浸提液和挥发物的敏感性与其致病力相关性分析

本研究利用形态学和分子鉴定的方法确证了尖孢镰刀菌是引起蒜瓣腐烂的致病菌。菌落抑制法分析表明:大蒜不同组织挥发物和浸提液对禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌均具有抑菌活性,不同组织挥发物和浸提液的抑菌活性为蒜瓣叶茎根。试验进一步分析了从腐烂蒜瓣上分离的尖孢镰刀菌群体和从小麦赤霉病样上分离的禾谷镰刀菌群体菌株对大蒜挥发物和浸提液的敏感性差异。结果表明:同一种内不同的菌株对挥发物和浸提液的敏感性差异较大。从腐烂蒜瓣上分离的尖孢镰刀菌对大蒜挥发物和浸提液敏感性较低;小麦赤霉病菌群体中绝大多数菌株对挥发物和浸提液敏感性较高,但也存在不敏感的菌株。致病力分析结果表明:所有从蒜瓣上分离的尖孢镰刀菌均能使蒜瓣致病,而禾谷镰刀菌中只有对挥发物和浸提液不敏感的菌株能引起蒜瓣腐烂。说明一些镰刀菌能对大蒜挥发物或浸提液产生抗性。因此,在利用大蒜与其他作物间作或轮作控制镰刀菌引起的根腐病时,应避免长期连续轮作,以免病原菌对挥发物和浸提液产生抗性,从而降低防治效果。     

应用巢式PCR检测黄瓜尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f．sp．cucumbrum)

文章应用BIK2/BIK3和BIK1/BIK4两对引物,采用巢式PCR(Nested-PCR)技术对镰孢菌属26个菌株(代表了6个镰孢菌种)以及从黄瓜根际分离的20株真菌、6株细菌和7株放线菌共计59个菌株进行了扩增。结果显示,只有3个黄瓜尖镰孢菌的致病菌株能产生一条长度大约为800bp的片断。对接种黄瓜尖镰孢菌的黄瓜植株进行检测结果表明,巢式PCR能从接种5d后的黄瓜病样中特异性地检测出病原菌,而症状的出现需要10～13d时间。该项技术具有较高的灵敏度,适用于黄瓜枯萎病早期侵染检测研究。     

鸡毒霉形体感染的PCR检测方法的建立及应用

用多聚酶链反应检测了鸡毒霉形体种内菌株的特异性ＤＮＡ片段,并用该法对人工感染鸡及野外野群进行了ＭＧ感染的分子流行病学调查。结果表明,通过基因扩增及电泳,仅ＭＧ出现特生扩增条带,最低能检出１８ｐｇＭＧＤＮＡ,说明该方法具有很高的特异性和敏感性。人工感染６０只鸡,３ｄ后即可用ＰＣＲ查出ＭＧ阳性,６ｄ后１００％为阳性,对照鸡全部为阴性。与分离培养的结果完全一致。ＰＣＲ对野外鸡群的ＭＧ检出率为１０．５－３     

安徽部分地区鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊的分离与鉴定

为获得纯种柔嫩艾美耳球虫虫株,从安徽省巢湖市、霍邱县、定远县3个地区患球虫病的鸡场采集3株混合球虫,培养至孢子化,分离单卵囊接种1～7日龄的雏鸡,感染后7～12 d,收集卵囊,然后通过生物学特性和PCR方法进行虫种鉴定。结果显示,3个地区的单卵囊感染成功率分别为50%、57%和29%,各虫株经生物学特性和PCR鉴定均为柔嫩艾美耳球虫。研究表明:1.0%琼脂单卵囊分离法简便且成功率较高,利用特异性引物PCR鉴定虫株,为纯种地方株的研究奠定了基础。     

转基因香石竹Moonlite品系特异性定性PCR检测方法的建立

以转基因香石竹品种Moonlite(月之伊人)为研究对象,通过TAIL-PCR方法,获得外源基因插入位点的左侧旁邻序列。根据旁邻序列设计引物,建立品系特异性定性PCR方法,其扩增片段覆盖了转化载体及香石竹基因组临界序列。本方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确、高效地检测转基因香石竹Moonlite品种。     

基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,CMM）,一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102）,永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法。[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫。根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18s和5.8srDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1（ITS-1）,PCR产物直接测序。[结果]成功地分离出肠艾美尔球虫,其卵囊扩增出434bp清晰条带,且最低能检测出27孢子化卵囊。[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础。     

切花康乃馨设施中早期杂草的发生消长与防除研究

康乃馨是我国主要的传统花卉之一，由于其生育期长，栽培条件优越，草害十分严重。通过研究，初步摸清了杂草的种类以及主要杂草的出苗消长规律，并对不同除草剂进行了评价和安全性测定，以３３％除草通ＥＣ４９５ｇ／ｈｍ２作土壤处理的除草效果最佳，且对康乃馨安全。     

低温贮藏对康乃馨切花瓶插寿命的影响

[目的]探索延长康乃馨切花瓶插寿命的方法和条件。[方法]研究了低温贮藏(0±1)℃的冷柜内贮藏5 d和10 d、(4±1)℃的冷柜内贮藏5 d对康乃馨切花"马斯特"采后生理代谢和瓶插寿命的影响,测定了瓶插期间康乃馨的花茎、鲜重、可溶性蛋白含量以及不同温度下的呼吸强度。[结果]以0℃贮藏5 d处理组的瓶插效果最好,有效抑制了康乃馨的生理代谢,推迟切花鲜重和可溶性蛋白峰值的出现,使切花的瓶插寿命延长(4.7±0.3)d,而4℃贮藏组切花的瓶插寿命较对照组缩短了(2.3±0.3)d。根据不同贮藏温度下感官评分/时间的线性回归方程,可以获得不同瓶插时间的感官得分。[结论]紧蕾期的康乃馨切花最佳的贮藏温度是0℃,最佳的贮藏时间是5 d。     

PCR检测鸭疫里默氏菌的研究

对本研究室分离、鉴定并保存的42株鸭疫里默氏菌(包括8个血清型)、9株鸭源大肠杆菌和4株鸭源禽多杀性巴氏杆菌进行PCR扩增，结果所有的鸭疫里默氏菌均能扩增出809bp的特异性DNA片段，而鸭源大肠杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌均为阴性。试验证明以细菌DNA和全菌体分别作模板，对PCR的扩增结果无影响。经过优化的该PCR方法能检测出的最低DNA量为1pg。     

外源乙烯对香石竹切花开放的影响

[目的]为了探寻简便安全的方法使香石竹(Dianthus caryophyllus L.)切花在短时间内盛开,以减短存货期并随时满足用花需求。[方法]采用乙烯利溶液喷撒花枝、将乙烯利加入瓶插液以及将乙烯利放在花枝旁边3组处理方法。[结果]适宜的乙烯浓度(环境中乙烯浓度为8.65×10-6 mol/L左右)可促使香石竹切花提前4～5 d盛开,观赏期达7 d,处理的花枝花色正常,最大花径和花枝重有所提高。但是高浓度乙烯、乙烯利溶液喷撒花枝和将乙烯利加入瓶插液均对香石竹产生明显伤害,造成花瓣变色、坏死,花朵不能完全开展。[结论]超过浓度阀值的外源乙烯能使香石竹切花迅速开放,在花枝旁边放置适量乙烯利溶液可有效地促进花朵盛开。