基因芯片及其研究进展

基因芯片(genechip)又称DNA芯片,是指将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可对大量核酸分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量的基因,使人们准确高效地破译遗传密码。这将是继大规模集成电路后又一次意义深远的科技革命。1基因芯片的特点1.1并行性高度的并行性不仅大大提高实验的进程,并且有利于DNA芯片技术所展示图谱的快速…     

基因芯片技术检测细菌耐药性

1　基本概念生物芯片 (Biochip)是指将大量的生物分子探针以大规模阵列形式排布在很小的载玻片、尼龙网等载体上 ,通过与标记的样品进行杂交 ,检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。依据生物分子探针的不同 ,生物芯片可分为很多种类 ,包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。目前研究最成功的且形成一定商业市场的是 DNA芯片 (DNAchip或DNA Microarry) ,又称为基因芯片 (Gene chip) ,即将无数预先设计好的寡核苷酸、c DNA、基因组 (Ge-nomic) DNA在芯片上做成点阵 ,与样品中同源核酸分子杂交。包括两种模式 :一是…     

动物疫病基因芯片诊断技术的研究进展

基因芯片(Gene Chip)又称DNA芯片或DNA微阵列(DNAmicroarray),是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面,并以此作为探针,在一定的条件下,与样品中待检测的靶基因片段杂交,通过检测杂交信号,实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测。它是分子生物学和微细加工技术(micro fabrication technology)相结合的产物。自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片,并制作出芯片系统,此后世界各国在芯片研究方面快速前进,不断有新的突破。它是生物芯片(Biochip)中发展最成…     

生物芯片在动物疫病及畜产品安全检测中的应用

生物芯片技术是随着"人类基因组计划"的进展而发展起来的,主要是指通过微加工和微电子技术等方法,将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,构建微型生物化学分析系统,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器对杂交信号的强度进行并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量,完成对生命机体生物组分准确、快速、大信息量的检测.由于常用玻片/硅片作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术.     

皮毛中5种病毒基因芯片检测方法的研究

根据GenBank上蓝舌病病毒(BTV)、O型口蹄疫病毒(FMDV)、山羊痘病毒(GPV)、绵羊痘病毒(SPPV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等5种病毒的特异性保守序列,分别设计多重荧光标记引物和相应寡核苷酸探针.使用芯片点样液稀释各探针至终浓度30μmol/L,点样制备11×11阵列芯片.核酸杂交后,建立并优化基因芯片检测方法.结果显示,使用470 mL/L甲酰胺杂交液,42℃摇转杂交4h为最佳基因芯片杂交条件.建立的基因芯片检测方法与伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)等无交叉反应,检测敏感性可达20拷贝病毒核酸.制备的基因芯片稳定,保存6个月可用.对151份临床样品进行基因芯片和商业化PCR试剂盒平行检测,两者的符合率为100％.     

猪3种重要病毒寡核苷酸芯片诊断方法的建立

将猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒-Ⅱ(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)分别应用生物信息学方法,针对病毒基因组保守序列设计特异性强的60-mer寡核苷酸探针,并将其按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片.分别设计出相应的引物,对待测样本进行不对称PCR扩增,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA片段,并通过间接荧光标记技术使扩增产物标记上荧光染料.将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交.扫描、分析芯片上荧光信号.试验结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号.而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号.不对称PCR技术制备的单链DNA片段与寡核苷酸芯片进行杂交反应可同时、快速、特异性地检测多种猪疫病病毒.     

猪瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法的建立

根据猪瘟病毒（CSFV）E2基因序列,设计41条针对CSFV 3个基因群共10个亚群各亚群寡核苷酸探针。利用欧盟猪瘟诊断手册推荐的CSFV E2基因套式RT-PCR方法,在内套PCR过程中进行Cy3-dCTP掺入荧光标记,制备芯片杂交样品。用标记的PCR产物与寡核苷酸探针阵列杂交,置于GenePix 4100A扫描仪中扫描,利用Ge-nePix Pro 6.0软件分析杂交图像。特异性和灵敏度试验显示,芯片方法与本室发表的CSFV real-time RT-PCR方法的灵敏度相近,芯片探针与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪2型圆环病毒（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）样品无非特异性杂交。以包括1.1、2.1、2.2、2.3亚群的8份CSF阳性样品进行芯片的检测验证,结果表明,通过特异性的杂交图谱或杂交信号分析可准确判定样品所属的基因亚群,寡核苷酸芯片的检测结果与测序的分型结果全部符合。本研究为将寡核苷酸芯片技术用于猪瘟病毒的基因分型和分子流行病学研究奠定了基础。     

基因芯片及应用

基因芯片是基于核酸分子杂交原理，利用光导原位化学合成或液相合成自动化点样技术，将大量的寡核苷酸探针固定于玻片，硅片、尼龙膜等固相支持物上，与荧光或同位素标记的样品核酸杂交，通过计算机系统检测与分析，获得有关的生物信息，它广泛应用于人类基因组研究，现代医学研究，动植物研究和环境保护等方面。     

分子育种研究手段之基因芯片技术

基因芯片技术是分子标记技术方法之一，其将大量的基因片段有序地、高密度地排列在固相载体上，称之为基因芯片。基因芯片技术是融生物学、物理学、化学、计算机科学、微电子学为一体的新技术，是90年代中期以来最重大科技进展之一，已经广泛用于许多物种的功能基因组学研究．具有重大的研究价值及产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上．所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析．从而解决了传统核酸印迹杂交自动化程度低．低通量等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值．如基因表达谱测定、突变检测。多态性分析、基因组文库作图及杂交测序（SBH）等，为”后基因组计划”时期基因功能的研究提供了强有力的工具，将会使新基因的发现．基因诊断等方面取得重大突破。     

猪瘟病毒和猪细小病毒检测基因芯片的构建

本试验克隆猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PV)各自病毒基因保守序列,提取质粒中的模板、扩增纯化作为探针,应用微量点样技术将探针固定在硝酸纤维素膜上,制备诊断基因芯片;同时对制备的基因芯片进行有效性监控和特异性、重复性的质量控制;然后提取样品核酸,PCR扩增并用生物素标记,并将所获得的扩增产物与诊断基因芯片进行特异性的逆向点杂交,最后通过芯片扫描来实现对病原的高效检测和分析判断。试验结果表明病料中抽提的核酸与芯片杂交的信号为阳性且较明显,说明制备的猪瘟病毒和猪细小病毒检测基因芯片有效性监控正常且两种病原的特异性和重复性均良好。     

DNA芯片技术及应用

生物芯片是指通过机器人自动打印或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列。根据分子间特异性相互作用的原理 ,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面 ,构建微流体生物化学分析系统 ,以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固定的生物分子的不同 ,可以将生物芯片划分为基因芯片或ＤＮＡ芯片、蛋白质芯片及芯片实验室 (Ｌａｂ -ｏｎ -ｃｈｉｐ)。而从其功能不同的角度 ,生物芯片又可以分为测序芯片、表达芯片和ＣＧＨ芯片。基因芯片是生物芯片研究中 ,…     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病，病毒（猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳）的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60mer寡核苷酸探针，制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记，标记样品与寡核苷酸芯片杂交后，进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示，4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交，芯片上呈现较强的阳性杂交信号，而除阳性质控探针外，阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫痛病毒。     

猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的构建

采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化,对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选,选择构建检测芯片的最适靶基因,进行基因芯片探针最佳标记方法试验.结果表明,质粒PCR扩增和采用异丙醇沉淀纯化的靶基因质量好,基因芯片最佳靶基因点样质量浓度为200mg/L,最佳探针质量浓度为3 000 μg/L,预杂交时间为1 h,杂交时间为3～6 h,杂交温度为48℃,以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个靶基因为构建TGEV检测芯片的最适靶基因,确定了多重PCR扩增标记TGEV探钟的最佳体系,Cy3-dCTP标记浓度为2.5 μmol/L,构建的TGEV检测芯片与标记的混合探针杂交效果好.     

猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征寡核苷酸芯片诊断方法的建立与初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）是引发猪繁殖障碍的主要病原,建立其基因芯片快速检测体系,对开发猪繁殖障碍快速检测试剂盒具有重要意义。根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因组序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。通过引物标记及特异性验证,建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。     

猪伪狂犬病、猪细小病毒病和猪流行性乙型脑炎检测基因芯片的制备及检测方法研究

对猪伪狂犬病(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒病(Porcine parvovirus,PPV)和猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)检测基因芯片的制备及该芯片的检测方法进行了研究。试验克隆和鉴定了16个芯片靶基因,经筛选,取其中13个靶基因PRV gB、gG、TK和gE;PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5制备PRV、PPV和JEV检测基因芯片,基因芯片点样系统SpotArrayTM 24将靶基因点样于氨基化玻片表面,靶基因最佳点样浓度为200 ng/μL,探针扩增标记反应体系中,Cy3-dCTP使用终浓度为2.5μmol/L,芯片杂交温度可在44℃～60℃之间任意选择。以PRRSV、CSFV、PCV1、PCV2、TGEV、HPS、PAP、E.coli和S.pp菌毒株DNA或CDNA为模板标记制备的探针均不与PRV、PPV、和JEV检测基因芯片杂交,芯片检测的灵敏度为3 pg/μL,芯片批间重复性好,同一张芯片可进行至少10次的重复杂交。该方法对8株PRV、5株PPV和JEV SA14-14-2单独或混合样品检测均为阳性,可区分伪狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品单独或混合感染的检出率分别为:单独感染PRV检出率15%(3/20),PPV 5%(1/20),JEV 0%(0/20);PRV和PPV混合感染检出率15%(3/20),PRV和JEV混合感染检出率5%(1/20),JEV和PPV混合感染检出率5%(1/20),三者混合感染的检出率5%(1/20)。与PRV、PPV和JEV多重PCR检测方法比较,芯片检测的灵敏度大大提高,同时可区分PRV野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品的检出率一致。     

用现代先进生物技术手段为畜产品安全『护航』——应用蛋白芯片检测兽药残留

生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子阵列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子结合,通过特定的仪器,比如激光共聚焦扫描仪对芯片信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量或含量.     

不对称RT-PCR结合芯片技术鉴别4种禽病的初步研究

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T／A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,鸡传染性支气管炎病毒np基因、新城疫病np基因、鸡传染性法氏囊A基因,并构建重组质粒;以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物中;并对扩增条件进行优化。研究发现检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确进行4种主要禽病的鉴别诊断和禽流感主要流行亚型鉴定,对感染样品和现地样品检测结果与RT．PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率分别为100％和96％。结果显示该方法可用于同步鉴别禽流感、鸡传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性法氏囊病,以及现地主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。     

猪病毒性腹泻检测基因芯片的两种样品标记技术比较

对猪病毒性腹泻检测芯片的两种样品标记方法进行比较。分别选取猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(GAR)的VP7和NSP4基因设计引物,用PCR扩增制备靶基因,纯化后制备猪病毒性腹泻联合检测基因芯片。提取样品核酸,采用Cy3直接标记法和间接标记法进行PCR扩增标记,标记的样品再与芯片杂交、扫描和数据分析,同时对两种标记方法的特异性、敏感性等进行了比较。结果表明,两种方法标记的样品均能与基因芯片特异性杂交,但直接法的中位信号值(median)均高于间接法的中位信号值,直接法的芯片杂交信噪比是用间接法的5倍以上。两种标记方法制备样品特异性好,猪蓝耳病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒验证检测为阴性;直接法和间接法的最低检测浓度分别为10~5和10~7 copies·μL~(-1),前者的灵敏性是后者的100倍。应用优化的直接标记法处理56份临床样品,进行芯片的检测应用,结果与RT-PCR一致。本研究结果表明直接法荧光标记样品可明显提高病毒性腹泻检测芯片的检测效果。     

非洲马瘟病毒、西尼罗病毒和马冠状病毒的基因芯片检测技术研究

为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为10²拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为10⁴拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。     

基因芯片方法检测6种动物源性人兽共患病病原

为了建立可同时检测H5亚型禽流感病毒、狂犬病病毒、猪链球菌2型、炭疽芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的基因芯片检测方法,本实验根据GenBank中上述6种病原的基因序列,设计并合成了特异性的引物和探针.采用点样法制备杂交芯片,将上述病原扩增产物混合后与芯片杂交.杂交结果显示,针对本试验中6种人兽共患传染病所设计的寡核苷酸探针可特异性识别靶基因,与其他常见病原体之间没有交叉反应.检测的灵敏度在1.38×10-5pg/μL～151 pg/μL之间.将建立的基因芯片检测方法对临床样品进行检测,结果与荧光PCR方法一致.