绵羊白细胞内的慢病毒cDNA GAG基因PCR检测

采用PCR技术,以绵羊外周血白细胞基因组为模板,扩增绵羊慢病毒gag基因全长,将该基因克隆到pBS-T载体上,将重组子转入感受态细胞DH5α,用IPTG/X-gel筛选阳性菌落,通过菌落PCR,酶切初步鉴定后测序,所测序列与Genbank中的基因序列进行比对,所克隆序列与慢病毒gag基因序列一致。实验表明:在绵羊的白细胞慢病毒的cDNAgag基因的PCR检测是可行的。     

利用梯度PCR和降落PCR扩增CIRP基因的比较

提取SD大鼠总RNA,同时应用降落PCR和梯度PCR在常规PCR反应体系和低模板浓度PCR反应体系中扩增CIRP基因片段,对两种方法的扩增效果进行比较。结果表明：降落PCR法可以通过一次反应即顺利扩增出CIRP基因特异性条带,并且在模板浓度降低后也能扩增出产物;梯度PCR法扩增结果不稳定,不但有非特异性条带出现而且不能...     

利用降落PCR扩增KS基因

通过优化SDS法提取链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)和2株由生物技术与资源利用国家民委——教育部重点实验室分离获得的放线菌D8和D18基因组DNA,同时应用降落PCR和普通PCR扩增酮基合酶基因(ketosynthase,KS)。结果表明,扩增出的特异性条带与目的基因片段长度一致,降落PCR法较普通PCR法扩增KS基因特异性更高。使用普通Taq酶,降落PCR程序能明显提高PCR的特异性,它可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

杨属转基因植物PCR检测内标准基因的建立

为了建立适用于杨属植物转基因成分PCR检测的内对照系统,利用目前genebank中已公布的杨属植物的叶绿体DNArbcL基因的保守区域,设计了两对PCR引物:rbcL-1引物和rbcL-2引物,分别成功地对五大派10种杨属植物进行了rbcL基因片段的扩增,第一次建立了适用于杨属植物转基因成分PCR检测的内标准基因对照系统。其中rbcL-1引物适用的退火范围很广,在52.0～68.0℃之间均能得到特异性很强的扩增产物,这有利于其他检测项目(如35S启动子、NOS终止子、标记基因及目标基因)的引物随意搭配进行多重PCR检测,从而提高检测效率、缩短检测周期。     

禽网状内皮组织增殖病病毒SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立

为了探究禽网状内皮组织增殖病的快速检测方法,根据禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)LTR和gag基因的保守区域各设计并合成一对引物,建立检测插入感染与全病毒感染的SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法(Real-time PCR)。以pMD-LTR,pMD-gag重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果表明:该方法线性关系良好;敏感性能检测到10拷贝标准品;能特异性检测REV样品,不与其它禽相关病原发生交叉反应;板内、板间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法对人工感染REV的鸡的心、肝、脾、肺、肾、盲肠扁桃体、腺胃和法氏囊进行初步检测,结果显示法式囊中的含量最高。     

普通PCR与TD-PCR扩增叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因的比较

为了比较普通PCR和降落PCR( TD - PCR)扩增Hepcidin基因的效果,通过Trizol法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA并合成cDNA,分别利用普通PCR和降落PCR扩增Hepcidin基因片段.结果显示,降落PCR能有效扩增叶尔羌高原鳅Hepcidin.测序结果显示:叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因...     

鹅细小病毒vp3基因PCR检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank上发表的鹅细小病毒B株基因序列,针对vp3基因设计并合成了一对特异性引物,建立GPV vp3基因的PCR诊断方法。结果表明,该方法扩增的产物与预期大小相符(约654bp),而其他相关病毒均为阴性反应,敏感度为12.4pg。对15份GPV疑似病例检出的阳性率为100%,而琼脂扩散试验(AGP)检出的阳性率为60%。证明建立的PCR方法特异性强、敏感性高,可用于临床病料的快速诊断。     

农杆菌介导gag基因和gp120基因转化番茄的初步研究

以4个番茄品种为材料，通过对子叶和茎段培养，建立了番茄组织培养的再生体系，为番茄的遗传转化提供了良好的受体系统；通过农杆菌介导，初步将HIV—l的gag基因、apl20基因和gag-apl20嵌合基因导入番茄，得到了抗性转化再生植株，再生植株PCR检测结果呈阳性，从而建立了良好的番茄遗传转化体系。     

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段.     

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立

伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。     

基于牙釉质基因巢式PCR性别鉴定 超微量DNA检测方法的建立

实验根据山羊牙釉质(AMEL)基因序列设计巢式引物,用紫外分光仪检测基因组DNA的浓度,梯度稀释(10 -2μg/μL、10-3 μg/μL,10-4μg/μL,10-5μg/μL),巢式PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测.结果表明,利用巢式PCR方法对10 pg量基因组DNA(约3个细胞)进行扩增,得到明显目的条带.巢式...     

一种适于PCR检测病毒诱导基因沉默番茄植株的微量DNA提取方法

【研究目的】为了寻找一种适用于病毒诱导的基因沉默番茄叶片PCR检测的快速、简单、成本低的DNA提取方法。【方法】笔者根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。【结果】提取基因组DNA所用的组织量虽少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶(Su)基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7A,片段大小分别为500bp、1300bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。【结论】该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

PCR法检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

[目的]建立一种快速准确检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。[方法]将金黄色葡萄球菌模拟污染的水增菌后提取菌体DNA,以沙门氏菌、大肠杆菌DNA和空白作对照,用PCR法扩增金黄色葡萄球菌肠毒素A基因。[结果]金黄色葡萄球菌DNA的检测结果呈阳性,检测底限达100 cfu/L,而大肠杆菌和沙门氏菌及空白对照均未出现特异性片段,整个检测过程只需要24 h。[结论]试验建立的PCR方法可检测水及类似食品中的金黄色葡萄球菌SEA基因,并具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的特点。     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x＋35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x＋34.890,R2=0.999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]该研究为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

转基因玉米的定性PCR检测

根据玉米内参照基因zSSIIb和转基因玉米中常见的CaMV35S、NOS、Bt、hpt等基因的特异性结构,设计5对定性PCR引物,经定性PCR检测,可以准确地将转基因玉米的目的基因检出,说明这5对引物具有较高的特异性和准确性。由此建立了一套转基因玉米定性PCR检测方法,用于转基因玉米及其产品的筛查、抽检。     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源,Ⅲ终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的cz值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的0值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为Y=-3．422x＋35．201,R^2=O．998;外源基因标准曲线方程为Y=-3．348x＋34．890,R^2=0．999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法

[目的]介绍一种适于拟南芥PCR检测的DNA快速提取方法。[方法]通过对常规DNA提取方法的改进,获得可以快速大批量地提取拟南芥DNA样品的方法,并以随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系为样品进行验证。[结果]经过琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收检测,DNA样品完整且污染少,PCR扩增目的片段结果良好,适于作为PCR反应的模板。经过对随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系的PCR检测,阳性植株目的基因扩增条带清晰,无假阳性,试验结果理想。[结论]该方法适用于拟南芥DNA样品的快速提取、PCR检测及拟南芥突变体筛选工作。     

慢病毒生产卵泡抑素转基因绵阳PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立稳定快速的慢病毒转基因羊DNA水平检测方法。[方法]采集初生转基因羔羊的子叶、脐带、尾组织以及死亡羔羊的全身各组织,提取基因组DNA作为模板进行PCR检测,以Follistatin基因N+D1片段特异性引物进行PCR检测;同时,对慢病毒载体的CMV启动子、5’-LTR等结构元件进行PCR检测;提取死亡羔羊的全身组织以及转基因羔羊的活体肌肉组织总RNA,进行RTPCR检测。[结果]采用试剂盒提取的基因组DNA比常规方法提取的DNA快速、高效,且更易被检测,扩增时的引物采用载体上游与目标基因下游的组合大大增加了检测的特异性,避免了内源性目标基因的干扰而造成假阳性;初生转基因羔羊的尾组织可作为PCR检测的组织样品,其结果可靠、准确;对CMV启动子及5’-LTR等结构元件作PCR检测为转基因动物的安全性考察提供了数据,同时验证了转基因羔羊目的基因的检测结果;对转基因羔羊肌肉组织提取总RNA后进行RT-PCR检测,其中有3只羔羊没有检测到转录产物,其他均有转录。[结论]该研究建立的转基因绵羊PCR检测方法高效、快速且准确,为进一步蛋白水平检测提供试验依据,也为建立转基因绵羊系统性多层次的检测方法奠定基础,还为转基因绵羊的安全监测提供了稳定的技术平台。     

PCR及核酸探针检测耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的研究

为了解耐甲氧西林葡萄球菌在畜禽间的存在情况.试验建立针对mecA基因的PCR方法及地高辛标记核酸探针技术,分别用两种方法对75株葡萄球菌分离株进行检测.结果显示,经PCR方法检出42株耐甲氧西林葡萄球菌,占分离株的56.0%;经核酸探针方法检出47株耐甲氧西林葡萄球菌,占分离株的62.7%,两种方法的总符合率为93.3%.通过研究证实,在畜禽的体表及体内能够分离到耐甲氧西林葡萄球菌,且有较高的分离率,应该引起兽医工作者的足够重视.