野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆分析与原核表达

超氧化物歧化酶是野桑蚕保护酶体系的重要酶类。利用RT-PCR方法克隆出野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)cDNA(EMB I登陆号:AM410997),其开放阅读框ORF长465 bp,编码154个氨基酸。同源性及系统进化分析表明,推导出的氨基酸序列与3种果蝇的同源性平均为69.3%,与线虫为57%,各物种中与Cu/Zn结合的残基高度保守。利用ExPASy的ScanProsite以及PSort和TMpred对此编码的蛋白质结构和功能域分析,预测出其具有2段Cu/Zn-SOD特异序列,且该蛋白不存在信号肽以及跨膜区。将Cu/Zn-SOD cDNA克隆到pET-28 a(+)表达载体,测序鉴定后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定其表达的融合蛋白质分子量为19.4 kD。     

流产布鲁氏菌的Cu/Zn超氧化物歧化酶的表达及其特性分析(英文)

本研究体外表达了流产布鲁氏菌的Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)并对表达产物进行了免疫原性分析。扩增编码Cu/Zn-SOD的基因,并将其克隆连接到pET-22b(+)载体中。SDS-PAGE结果显示诱导细菌的裂解物有重组Cu/Zn-SOD表达,分子量为20.8 kDa。Western blot结果显示重组Cu/Zn-SOD均与鼠、牛的阳性血清反应。由此,说明体外表达的重组Cu/ZnSOD具有很好的抗原性,为今后疫苗开发及诊断试剂的开发奠定了物质基础。     

海兰褐鸡法氏囊中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及NOS cDNA克隆及序列分析

通过对海兰褐鸡法氏囊中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及iNOS cDNA克隆及序列分析,了解海兰褐鸡法氏囊中主要氧化-抗氧化酶的分布及其基因组成,为研究传染性法氏囊病及与法氏囊相关禽病的氧化-抗氧化发病机制奠定基础.结果显示,Cu/Zn-SOD、Mn-SODcDNA序列分别出现2个碱基的突变,iNOS cDNA序列与原始序列同源性为100％.海兰褐鸡法氏囊中存在Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及iNOS 3种与氧化-抗氧化相关酶,并且Cu/Zn-SOD、Mn-SOD cDNA序列具有新特征,iNOS在海兰褐鸡体内是稳定存在的;海兰褐鸡可能与康奈尔K系鸡具有相似的遗传背景.     

桑螟胞外铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与融合表达及重组蛋白酶活性检测

桑螟(Glyphodes pyloalis)是蚕区桑园的主要害虫之一,鉴定其抵御各种环境胁迫相关的基因,是制定防治新策略的重要理论依据。对桑螟幼虫转录组数据的分析中,发现桑螟胞外铜锌超氧化物歧化酶(ec Cu/Zn SOD)基因在应对高温胁迫时的表达量发生显著变化。为了明确ec Cu/Zn SOD在桑螟应对不良环境中发挥的作用,克隆和鉴定了其编码基因Gpec Cu/Zn SOD(Gen Bank登录号:MG566057)。Gpec Cu/Zn SOD基因的开放阅读框长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白质序列与脐橙螟(Amyelois transitella)的一种SOD蛋白基因(Gen Bank登录号:XP_013197347.1)编码氨基酸序列的一致性高达83%。采用邻近相接法构建桑螟与其他昆虫的Cu/Zn SOD系统发生树,结果显示Cu/Zn SOD被分为ec Cu/Zn SOD和ic Cu/Zn SOD两类,主要是随物种进化而进化。采用半定量RT-PCR检测不同温度处理桑螟5龄幼虫的Gpec Cu/Zn SOD基因表达情况,结果显示幼虫体内的Gpec Cu/Zn SOD在高温(40℃)和低温(4℃)条件下表达量最高。构建p Cold-Gpec Cu/Zn SOD重组表达质粒,并在大肠埃希菌中实现异源表达。利用镍柱亲和层析法分离纯化重组Gpec Cu/Zn SOD蛋白,采用WST-1法测定重组Gpec Cu/Zn SOD蛋白在40℃时的酶活性最高,并且经60~70℃处理后仍然具有较高的酶活性。采用牛津杯法分析重组Gpec Cu/Zn SOD的抗氧化活性表明:过表达Gpec Cu/Zn SOD的大肠埃希菌抗氧化的能力显著增强,显示Gpec Cu/Zn SOD具有较强的抗氧化功能。研究结果暗示Gpec Cu/Zn SOD在桑螟应对高温胁迫过程中发挥着重要作用。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA克隆测序及其分子进化研究

对牦牛Cu/Zn-SOD cDNA进行克隆测序。所扩增片段长度为842bp,编码区长度为459bp。扩增片段与奶牛Cu/Zn-SOD cDNA序列比较发现有16个碱基存在差异。通过与已知Cu/Zn-SOD cDNA序列的7个物种:人、猪、鼠、大鼠、奶牛以及马的cDNA序列的比较构建了分子进化系统树。对所得序列的ORF分析发现,牦牛Cu/Zn-SOD由152个氨基酸组成,并对氨基酸序列进行了比对分析。     

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。     

qRT-PCR检测柞蚕中肠热休克蛋白基因ApHSC70对微孢子虫入侵的响应

为证实柞蚕热休克蛋白在柞蚕防御体系中的作用,利用RT-PCR技术在柞蚕5龄幼虫中肠组织克隆了一个热休克蛋白基因Ap HSC70(Gen Bank登录号:KJ437496),并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在感染柞蚕微孢子虫的柞蚕中肠中的表达变化。该基因的开放阅读框(ORF)长1 959 bp,编码652个氨基酸,预测蛋白质分子质量为71.49 k D,等电点(p I)为5.38,具有细胞质特征基序,推测为一种组成型热休克蛋白;Ap HSC70与斜纹夜蛾、棉铃虫同源蛋白质的序列相似度最高,分别达96.94%、96.33%。感染柞蚕微孢子虫后0~9 h的柞蚕5龄幼虫中肠组织中,Ap HSC70基因转录水平变化不大,但感染后12 h该基因的转录水平开始升高,至感染后21 h达到最高值。研究结果表明,柞蚕中肠组织的Ap HSC70基因在柞蚕微孢子虫入侵时的表达变化呈现出一定的应激响应,表达量最高可上调近5倍,推测该基因可能参与了柞蚕的免疫防御过程。     

柞蚕核型多角体病毒ptp-1、ptp-2基因序列比较及转录分析

柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyinucleopoly hedrovirus,ApNPV)是柞蚕脓病病原,有关ApNPV的分子生物学研究可为病害综合防治提供理论依据。对ApNPVptp-1、ptp-2基因序列特性进行计算机辅助分析,并就其转录特性进行RT-PCR分析。结果表明:ApNPVptp-1、ptp-2基因均具有早期基因序列特性,但在柞蚕蛹体内这2个基因分别于感染后72、96 h开始转录,属于杆状病毒晚期基因家族。只有部分鳞翅目杆状病毒编码ptp-1、ptp-2基因同源区,非鳞翅目杆状病毒不编码ptp-1、ptp-2基因同源区,而ApNPV为鳞翅目杆状病毒,同时编码ptp-1、ptp-2基因同源区。PTP-1、PTP-2蛋白氨基酸序列中均含有双特异性蛋白磷酸酶(DSPc)结构域和酪氨酸特异性蛋白磷酸酶结构域,但在杆状病毒生命周期中,这2个蛋白是否具有相同的功能尚不清楚。     

ApDHAR基因的克隆与RT-qPCR 检测

在柞蚕体内,由其他昆虫脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)序列设计引物,克隆得到ApDHAR基因。并运用RT-qPCR方法,在体外注射维生素C条件下,测定该基因在4龄柞蚕幼虫体内表达量的变化,初步检验该基因的功能,以期为研究柞蚕维生素C代谢的分子机理提供帮助。     

铜、铬营养及其互作对产蛋鸡脂类代谢的调节作用

按2×3因子安排的完全随机设计,选取96只24周龄的海兰褐蛋鸡,随机分为6组,铜添加0和150mg/kg,铬添加0,600μg/kg,1000μg/kg。试验8周后测定肝脏、血清中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量,并分析对肝脏谷胱甘肽(GSH)和铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、血清卵磷脂酰基转移酶(LCAT)和胰岛素(Ins)的影响。结果表明,添加150mg/kg铜能够提高产蛋率5.8%(P=0.048),显著降低肝脏、血清TG、TC水平。补充高铜显著提高GSH产量(P<0.01),增强Cu/Zn-SOD活性(P<0.01),降低Ins水平(P<0.01),显著增强LCAT活性(P<0.01)。补充铬能够显著降低采食量(P<0.01),降低肝脏TC,血清TG和TC,增强Cu/Zn-SOD的活性(P<0.05)。铜和铬对日采食量和料蛋比有负互作效应,对降低血清TG存在互作效应。     

野桑蚕12S rRNA基因的克隆及序列分析

通过PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的12SrRNA基因进行了克隆和序列分析。结果表明,青州野桑蚕12SrRNA基因为788nt,在DNA水平上,与家蚕12SrRNA基因的同源性达到99%,与中国陕西安康、日本筑波来源的野桑蚕12SrRNA基因的同源性分别为97%、98%;分子进化分析显示,家蚕可能是起源于中国野桑蚕。     

野桑蚕脑组织cDNA文库的构建及化学感受蛋白基因(CSP3)的克隆和序列分析

利用TAKARA公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕脑组织的cDNA文库,经鉴定文库的滴度达3.5×105pfu/mL,文库插入片段的平均大小为1.2kb。从文库的测序结果中获得野桑蚕化学感受蛋白基因(CSP3)完整的开放阅读框(登录号:EU439267)并对其进行了序列分析。结果表明:该基因读码框由384个核苷酸组成,编码127个氨基酸,分子质量为14.6kD。通过对该基因编码的氨基酸和其它17种昆虫的CSP编码的氨基酸进行进化分析,发现该基因与家蚕CSP3的同源性最高,达96.85%。该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对化学农药的敏感性差异具有重要意义。     

基于mtDNA ND1基因的家蚕进化分析

对中国青州野桑蚕mtDNA中ND1基因进行了克隆和序列分析。结果显示,野桑蚕ND1基因全长为933bp,编码310个氨基酸残基,A+T含量较高,达78.7%;同源性分析显示,不同来源的家蚕和野蚕ND1基因在核苷酸水平和氨基酸水平具有很高的相似性;以ND1基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。用mtDNA的ND1基因的核苷酸序列Blast家蚕的基因组序列,发现家蚕基因组中存在与ND1基因部分区域同源的序列,表明家蚕基因组中存在起源于线粒体的假基因。     

从云南省地方黄茧品种B黄2克隆的类胡萝卜素结合蛋白基因的cDNA序列分析

类胡萝卜素结合蛋白(CBP)是家蚕黄茧形成的关键因子。利用RT-PCR方法从云南省地方黄茧品种B黄2的5龄幼虫丝腺中克隆了编码CBP的基因cDNA序列。序列及同源性分析表明,克隆的CBP基因cDNA序列全长898bp,编码297个氨基酸残基组成的蛋白,该序列与从日本黄茧品种N4的丝腺中克隆的编码CBP的基因(GenBank登录号:AB062740)序列相似性为100%。生物信息学分析表明该序列编码的CBP蛋白为非分泌型蛋白,且定位于细胞质中的可能性最大。研究结果显示云南黄茧品种B黄2与日本黄茧品种N4的CBP基因CDS序列完全一致,编码蛋白也一样,证明黄茧品种B黄2的茧色不同于N4的茧色,并非是由CBP基因序列产生变异位点导致的,色彩的差异可能是受到黄茧系其它茧色形成因素的影响。     

家蚕P450基因CYP305B1的基因组序列克隆及结构分析

为了研究家蚕P450基因CYP305B1的结构,采用反向PCR技术克隆了家蚕CYP305B1基因的基因组序列,经序列测定,拼接得到家蚕CYP305B1全基因序列,发现家蚕CYP305B1的第1内含子位于5′端非翻译区序列(5′-UTR)中间。将家蚕CYP305B1与野桑蚕P450基因CYP305B1V1序列进行同源性比较的结果表明,二者在5′-UTR上游-400～-770 bp序列间的同源性只有40.4%,序列差异最大的是第1内含子和第6内含子。在第1内含子中,野桑蚕CYP305B1V1在翻译起始密码ATG上游-340之前存在330 bp的插入序列,在-110～-340 bp间二者的同源性也只有46.9%;在第6内含子中,家蚕CYP305B1比野桑蚕CYP305B1V1多了一段约300 bp的插入序列。研究结果有助于进一步探究该基因的转录和调控机制。     

野桑蚕线粒体ND5基因及其两端侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的ND5基因及其两端侧翼区域进行了克隆和序列分析。结果表明,在所测定的2．2kb左右的片段中,含有ND5基因的完整序列及Phe-tRNA(UUC)、Ser-tRNA(AGC)、Glu- tRNA(GAA)、His-tRNA(CAC)等4个tRNA基因,该片段的基因组结构与家蚕及其它地域来源野桑蚕的基因组结构基本一致,显示蚕类线粒体基因排列的保守性。ND5结构基因在不同家蚕及野桑蚕之间的比对分析表明,它们在核苷酸水平、氨基酸水平的同源性很高,相似性达96%以上。4个tRNA基因的碱基错配率较高,TψC环缺乏相对保守的T-ψ-C-Pu-A序列,各臂的碱基配对数、各环碱基数目变化较大。以ND5基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。     

野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara的克隆与选择性剪接

昆虫的钠离子通道蛋白是许多神经毒性药物的作用靶标。根据家蚕钠离子通道蛋白基因(GenBank登录号:EU688970)序列设计引物,分段RT-PCR克隆了野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara(GenBank登录号:EU688972)。序列分析表明,Bmmpara基因的cDNA长5553bp,编码1851个氨基酸,与家蚕基因组序列比对,存在34个外显子,其中第2、22、27外显子存在选择性剪接。根据Bmmpara序列和家蚕基因组序列设计引物,采用PCR方法克隆到3段野桑蚕基因组序列,长度分别为1632、536和3220bp。进一步将Bmmpara编码氨基酸序列与野桑蚕基因组比对,发现有a(ENDLGRTKKKK)、b(GL-KAALCGRCVSS)、c(SLINFVAALCGAGGIQAFKTMRTLRALRPLRAMSRMQGMRV)3个选择性微外元,可能存在6种选择性剪接,构成野桑蚕钠离子通道蛋白不同亚型。     

柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA3′端的克隆及序列分析

柳蚕(Actias seleneHbner)是野生泌丝昆虫。从柳蚕雌蛹脂肪体中提取总RNA,根据已经解析出的其它泌丝昆虫的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物,对柳蚕卵黄原蛋白cDNA3′端进行RACE(rapid amplification ofcDNA ends)扩增,经克隆和测序得到了一条1 072 bp的cDNA片段,该序列与柞蚕(Antheraea pernyi)、天蚕(An-theraea yamamai)、野桑蚕(Bombyxmandarina)、家蚕(Bombyxmori)、樗蚕(Samia cynthia pryeri)、蓖麻蚕(Philosamiacynthia ricini)、樟蚕(Saturnia japonica)相应序列的同源性分别为82.5%、82.4%、67.0%、63.2%、80.3%、78.5%、81.0%。同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有较高的保守性。     

中国野桑蚕滞育激素基因的克隆与序列分析

根据家蚕DH PBAN基因序列设计特异引物 ,以中国野桑蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得了1 5 85kb的目的片段 ,将其克隆进pMD18 T载体 ,测序和同源性比较结果表明 :该片段由 3个外显子、2个内含子组成 ,2个内含子均为典型的GT AG结构 :该片段编码中国野桑蚕滞育激素 (DH)及DH引导肽 ;中国野桑蚕DH及引导肽与家蚕及日本野桑蚕的DH及引导肽氨基酸序列完全相同 ,其基因cDNA序列的同源性分别为 99 3%、97 2 %。研究结果进一步显示了中国野桑蚕与家蚕之间的近缘关系。