泡桐AFLP反应体系的建立及引物筛选

以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物.     

蜡梅AFLP反应体系优化及引物筛选

通过对影响AFLP反应体系主要因素的优化,建立了蜡梅的AFLP反应体系,并筛选出了适宜该体系分析的引物.结果表明,20μL蜡梅AFLP最佳酶切体系为模板600 ng DNA,3 U Pst I和3 U Mse I,在37℃下双酶切2 h;在20μL最佳连接体系中酶切产物为15μL,3 U T4连接酶,0.25μmol.L-1 Pst I接头,2.5μmol.L-1 Mse I接头,1μL 10×T4 Buffer,在22℃下连接10 h;在20μL最佳预扩反应体系中稀释10倍的连接产5μL,2.0mmol.L-1 Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC);在20μL最佳选择性扩增反应体系中5μL稀释20倍的预扩增产物,2.0 mmol.L-1的Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1 dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC).最后,利用上面的体系筛选出了96对适宜于蜡梅AFLP分析的引物.     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

松毛虫AFLP反应体系的建立及引物筛选

为研究不同环境条件下松毛虫的遗传多样性,以油松毛虫为材料研究松毛虫的AFLP反应体系。对选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析。结果显示,在选择性扩增体系中,预扩增产物稀释40倍,Mg2+浓度1.5 mmol/L、dNTP浓度0.2 mmol/L,引物浓度0.500pmol/L,Taq酶用量为1U,扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到稳定的结果。用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合。     

毁灭炭疽菌RAPD和ISSR-PCR最佳反应体系的建立

对影响PCR反应的主要因子-Md2+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化,建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系.RAPD反应体系(25μL):Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Taq酶用量为1U,引物浓度1μmol/L.ISSR反应体系(25μL)为:Mg2+浓度为2 mmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,Taq酶用量为0.5 U,引物浓度为1.25 μmol/L.     

禺毛茛SRAP反应体系优化及引物筛选

以禺毛茛叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以10×Buffer、Mg2+、dNTP和引物4种因素3个水平,对禺毛茛SRAP反应体系进行研究,并比较了不同浓度模板DNA、Taq酶用量对扩增效果的影响,建立了禺毛茛的SRAP最佳反应体系.结果表明,禺毛茛SRAP-PCR最佳反应体系为:20 μl反应体系中,10×Buffer 2.5 μl,25 mmol/L Mg2+ 2.5 μl,2 mmol/L dNTPs 1.5 μl,5 μmol/L引物1.0 μl,模板量为100～200 ng,Taq酶0.5 U.运用该体系对10份禺毛茛进行验证,证明该体系稳定可靠,并从100个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的36个引物组合.这一优化的体系及多态性引物组合为利用SRAP标记技术进行毛茛属植物分子遗传学研究提供了科学依据.     

分蘖洋葱ISSR-PCR扩增体系的建立

以分蘖洋葱幼嫩叶片DNA为试材,采用单因素试验,对ISSR-PCR扩增体系中的退火温度、模板DNA量、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量以及引物浓度等各因素进行优化.结果表明,在反应体系为25μL反应液中,包含DNA模板40 ng(2μL),10×PCR Buffer 3μL,Mg2+(2.5 mmol·L-1)2μL,dNTPs(2.5 mmol·L-1)3μL,引物(5 mmol·L-1)3μL,Taq酶(5 U·μL-1)0.4μL,退火温度为56℃时,分蘖洋葱ISSR-PCR扩增获得最佳效果,初步建立分蘖洋葱叶片最佳ISSR-PCR扩增体系,为ISSR分子标记技术应用于分蘖洋葱种群遗传多样性分析、遗传图谱构建、核心种质资源保存利用等奠定分子生物学的理论基础和技术支撑.     

苦豆子RAPD反应体系的优化

以苦豆子基因组DNA为模板,采用单因素递进筛选和全面正交设计相结合的方法,获得苦豆子RAPD扩增反应的优化体系.结果表明:在20μL反应体系中,DNA模板20 ng,引物浓度为30μmol/L,Mg2+浓度为50μmol/L,Taq DNA聚合酶2.5 U/μL,dNTP浓度为5 mmol/L,10×PCR Buffer 2.0μL.优化后的体系扩增产物稳定,条带清晰.利用随机引物09M27412对5份苦豆子DNA进行扩增,证实该体系重复性好,结果稳定,可作为苦豆子遗传多样性分析的1个稳定体系.     

海岛棉组培mRNA差异显示体系的建立

[目的]建立适合海岛棉组织培养过程中差异基因表达研究的DDRT-PCR体系.[方法]试验选取海岛棉体胚发育过程中的胚性愈伤组织,无菌苗下胚轴为对照.对引物浓度、dNTP浓度、酶浓度和退火温度等影响差异显示PCR的关键因素进行单因素优化实验.[结果]确定了海岛棉组织培养差异显示PCR体系为(10 μL):cDNA 2 μL;dNTP 200 μmol/L;上游引物0.4 μL(10 μM),下游引物0.5 μL(10 μM);Taq酶0.5 U,Buffer1.0 μL.前5个循环退火温度为50℃,后30个循环退火温度为57.1℃.[结论]用该体系扩增,PCR产物特异性高,条带清晰,背景污染少.     

独尾草DNA提取方法优化及ISSR反应体系的建立

为研究独尾草(Eremurus chinesis Fedtsch.)的遗传多样性,以独尾草的干燥叶片为研究材料,比较了SDS法和CTAB法提取独尾草总DNA的效果,并对CTAB法提取方法进行了优化.采用正交试验以Mg2+、dNTP、Taq酶、引物4因素3水平建立了独尾草的ISSR反应体系.结果表明,优化的CTAB法提取独尾草DNA的质量较好,在l0 μl的反应体系中,含10×PCR Buffer、1.0 mmol/l MgCl2、200 μmol/l dNTP、0.75 U Taq酶、0.4mol/l的引物和20 ng模板DNA.基于上述ISSR反应体系,筛选出了适合独尾草遗传多样性分析的21条ISSR引物.     

麻栗坡兜兰ISSR引物筛选及反应体系的优化

[目的]对麻栗坡兜兰ISSR引物进行筛选,并建立一个稳定性高、重现性好、适合麻栗坡兜兰ISSR反应体系。[方法]以麻栗坡兜兰DNA为模板,分别对Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等PCR反应成分进行优化,并用优化的体系对25条兰科中报道的ISSR引物进行筛选。[结果]确立了麻栗坡兜兰最适ISSR-PCR反应体系:在25μl反应体系中,Mg2+2 mmol/L、引物0.4 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、DNA 1.5μl、Taq酶1.4 U。利用该体系,共筛选得到10条ISSR引物用于麻栗坡兜兰分析,并对21份麻栗坡兜兰材料进行扩增,获得了较好的扩增效果。[结论]该体系稳定可靠,为今后ISSR标记在兜兰属植物的种质鉴定、遗传多样性等方面的广泛应用奠定了重要基础。     

温郁金ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]寻找一个可用于温郁金ISSR-PCR的最适宜反应体系。[方法]利用CTAB法提取基因组DNA,同时利用PCR扩增技术和方法,对引物、模板DNA、Mg2+d、NTP、Taq聚合酶等反应条件进行优化。[结果]反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度(25mmol/L)2.2μl,Taq聚合酶(5 U/μl)0.4μl,引物浓度(20μmol/L)1.5μl,模板DNA(5 ng/μl)1.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2.2μl,10×PCRbuffer2.5μl;PCR扩增程序为:1个循环的94℃预变性5 min;94℃变性35 s,相对应的引物退火温度退火1 min,72℃复性1.5 min,共36个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]该体系是适合温郁金ISSR-PCR反应的最适宜体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带清晰而稳定等特点,为今后温郁金遗传多样性的研究奠定了基础。     

老芒麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立并优化老芒麦ISSR-PCR反应体系和扩增程序,以期为探讨老芒麦种质资源的遗传多样性提供科学依据。[方法]采用正交设计试验和单因素试验相结合的方法对老芒麦的ISSR-PCR的反应体系进行构建和优化,对影响ISSR-PCR扩增效果的Taq酶、模板DNA的浓度、Mg2+、dNTP和引物浓度等因素进行优化,同时对退火温度、循环次数和延伸时间进行筛选。[结果]在25μl体系中各反应物的最适含量为:0.2 mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,1.50 U Taq DNA聚合酶,2.5μl 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2和40 ng模板DNA;循环次数和延伸时间分别是35次和90 s。[结论]该研究建立并优化了老芒麦ISSR-PCR反应体系,通过2份老芒麦种质对所优化体系得验证,结果显示体系稳定,可用于老芒麦种质资源遗传分析。     

蝴蝶兰RAPD反应体系的建立

为建立一个稳定的蝴蝶兰RAPD反应体系,对RAPD反应体系中模板DNA、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2+浓度和dNTPs浓度等各项参数进行筛选比较。结果表明,最佳反应体系为:25μl反应体系中,其中含模板DNA(20 ng/μl)1.5μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.4μl,随机引物(20μmol/L)1μl,Mg2+(25 mmol/L)2.5μl,dNTPs(10 mmol/L)0.5μl,10×PCR Buffer2.5μl,ddH2O 16μl。     

朝鲜白头翁RAPD反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取朝鲜白头翁的基因组总DNA,建立朝鲜白头翁RAPD分析的PCR反应体系,成功进行RAPD扩增.筛选出的最佳PCR反应体系为:25μL反应体系中包括模板DNA 20ng,dNTP 200μmol/L,引物0.4μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1 U,10×Buffer 2.5μL,其余部分为无菌重蒸馏水.     

4种楠木AFLP反应体系优化建立

采用核酸电泳缓冲液（TNE）结合十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取的高质量楠木Phoebe基因组脱氧核糖核苷酸（DNA）可满足扩增片段长度多态性（AFLP）分析的要求。利用浙江楠Phoebe chekiangensis基因组DNA优化建立楠木AFLP反应体系如下:酶切反应300 ng基因组DNA,0.3 L缓冲液4,0.3 L牛血清白蛋白（100 BSA）,50 nkat EcoR,25 nkat Mse,双蒸水加至30.0 L放置37 ℃恒温箱酶切4 h,聚合酶链式反应（PCR）仪上65 ℃15 min;连接反应20.0 L酶切产物,2.5 L T4缓冲液,666.8 nkat T4 连接酶,5 pmol EcoR接头,10 pmol Mse接头,双蒸水加至25.0 L,16 ℃连接过夜（10 ~14 h）;预扩增反应2.0 L连接产物,2.0 L 10 缓冲液,31.25 nmol镁离子,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,4 pmol脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）,预扩增引物（E＋A,M＋C）各6 pmol,双蒸水加至20.0 L;选扩增反应稀释40倍的预扩产物2.0 L,2.0 L 10缓冲液,31.25 nmol镁离子,4 pmol dNTP,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,选扩增引物（M＋CNN）15 pmol,选扩增引物（E+ANN）12 pmol,双蒸水加至20.0 L。利用上面体系在64对选扩引物中筛出13对适于浙江楠AFLP分析的最佳引物组合。图5表3参24     

松毛虫mtDNA PCR反应体系优化

为了应用线粒体DNA研究松毛虫种群的遗传结构,本研究采用正交试验设计法L16(45)对影响松毛虫mtDNA PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验并对PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了单因素梯度比较优化。建立了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳体系即在50μL体系中含模板150 ng、0.10μmol/L引物、0.4 mmol/L dNTP、1.0UTaq DNA聚合酶、2.5 mmol/LMg2+。同时通过PCR比较,确定最佳循环次数为35个循环,最佳退火温度为56℃,获得了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳扩增程序。     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。