草菇多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】解析草菇多酚氧化酶基因家族序列信息,明确其特征和表达模式。【方法】通过转录组测序找出含有酪氨酸酶结构域的基因,并根据搜索得到的序列设计引物,以不同发育时期的草菇 v26 菌株,以及草菇蛋形期外菌膜、菌盖、菌柄等不同组织为材料提取 RNA,经反转录为 cDNA,扩增获得草菇多酚氧化酶基因序列。采用在线生物信息学网站预测草菇多酚氧化酶的理化性质。采用 RT-PCR 的方法,检测草菇不同发育时期和不同组织部位多酚氧化酶的表达模式。【结果】获得 4 个草菇多酚氧化酶基因家族的 CDS 序列,依次命名为 VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3、VvPPO4,其中 VvPPO1 CDS 全长 1 596 bp、编码 531 个氨基酸,VvPPO2 CDS 全长 2 685 bp、编码 894 个氨基酸,VvPPO3 CDS 全长 1 593 bp、编码 530 个氨基酸,VvPPO4 CDS 全长2 067 bp、编码 688 个氨基酸。生物信息学分析表明,4 个基因编码的蛋白均含有 2 个铜离子结合区,为亲水性蛋白;RT-PCR 结果显示,4 个基因在草菇发育的菌丝期、原基期、蛋形期、成熟期均有表达,VvPPO1、VvPPO3 和VvPPO4 的表达量在子实体时期高于菌丝期,在蛋形期 VvPPO1 和 VvPPO4 在外菌膜的表达量比在菌柄和菌盖中的表达量高。【结论】在草菇中搜索得到 4 个多酚氧化酶基因,均含有 2 个铜离子结合区,4 个基因在各个发育时期均有表达。     

草菇菌种退化相关分子标记的筛选

【目的】基于SRAP分子标记技术,筛选出与草菇(Volvariella volvacea)菌丝退化性状紧密连锁的分子标记,为进一步研究目标性状基因的克隆与功能奠定基础。【方法】以草菇正常生长菌株V51(对照)与其菌丝退化菌株(VNM1~10)为材料,采用群体分离分析法分别构建2种草菇的近等基因池。利用SRAP分子标记技术,寻找两类菌株的差异片段,回收差异片段后与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD-VNMDF并转化E.coli DH5α感受态细胞,将筛选的阳性克隆测序。根据差异片段序列设计引物,将其转化成SCAR分子标记,并对草菇正常菌株V51及其菌丝退化菌株VNM进行扩增试验,验证该标记的真实性和可靠性。【结果】81对SRAP引物组合中有2对引物可扩增出稳定差异条带,其中引物对Me8-Em4PCR扩增出长度约300bp的差异条带(命名为VNMDF)存在于退化菌株中。对SRAP分子标记片段VNMDF回收、测序并进行序列分析发现,该片段长度为279bp,其核酸、氨基酸序列与编码26S蛋白酶体亚基的相似性分别达到81%和93%。利用SCAR特异引物对SCAR250可在菌丝退化菌株中稳定扩增出长度约250bp片段,与预期大小(279bp)一致,而在正常菌株中未扩增出此片段。【结论】获得了1条可能与草菇菌丝退化性状基因紧密连锁的SRAP分子标记,并将其成功转化为SCAR标记(SCAR250)。     

花生CEM1基因的克隆及表达载体构建

通过规模测序和生物信息学分析,从花生荚果不同发育时期全长cDNA文库中筛选出MADSbox家族的一个cDNA全长序列,命名为CEM1基因(GenBank登录号为EY396043)。该基因全长1 061 bp,包含762 bp的开放阅读框,编码253个氨基酸,蛋白质的分子量为29.405 ku,等电点(pI)为9.18。蛋白质信号肽分析和疏水性分析表明,该基因编码的蛋白质信号肽剪切的可能性很小,具有亲水性。同时构建CEM1基因的VIGS表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

黏虫溶菌酶基因Mswly的克隆与真核表达

为了研究溶菌酶在害虫抵抗虫生真菌中的作用及分子机制,以黏虫为试验材料,利用RT-PCR和RACE技术获得黏虫溶菌酶基因Mswly的全长序列,同时采用体外真核表达系统对Mswly基因进行蛋白质表达。克隆、测序后分析表明,Mswly基因的cDNA全长为652 bp(GenBank登录号为MG692501),开放阅读框序列长度为426 bp,编码141个氨基酸。其编码蛋白质分子质量为16.26 ku,理论等电点为6.57;含有信号肽,剪切位点在第20个和21个氨基酸之间;含有溶菌酶活性所需要的谷氨酸和天冬氨酸活性位点。系统进化树分析表明,Mswly与其他物种的C型溶菌酶聚集在一起,说明Mswly为C型溶菌酶。Western blotting结果显示,Mswly重组蛋白大小约17 ku,与预期分子质量大小一致,说明Mswly基因在昆虫Sf9细胞系能够高效表达。综上,从黏虫脂肪体中克隆得到了1个C型溶菌酶基因Mswly的完整cDNA序列,并将其在草地贪夜蛾细胞系Sf9中进行了高效表达。     

禾谷镰孢菌微管相关蛋白基因(map)克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum) 测序菌株NRRL31084(PH-1) 的微管相关蛋白基因(map) 核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法测定了禾谷镰孢菌埘多菌灵(MBC) 不同敏感性表型的6个中国菌株的map全序列.DNA序列比对表明,中国的3个敏感菌株和3个抗药菌株的map核苷酸序列相似性没有差异,表明多菌灵抗药性与微管相关蛋白无关.该基因全长1 793 bp,含有6个内含子,编码199个氨基酸;与NRRL31084的map核苷酸序列相似性为99.39%,存在10个差异核甘酸,与其所编码的氨幕酸序列相似性为100%.     

草菇谷胱甘肽过氧化物酶编码基因vv-gpx01的序列特征及表达分析

依托草菇基因组及转录组数据,克隆得到1个谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)编码基因,命名为vvgpx01。ZOOM软件的分析结果表明:该基因全长1 313 bp,含有4个外显子、3个内含子,编码228个氨基酸;5'端非翻译区长为12 bp,3'端非翻译区为452 bp;其中3个内含子在RNA加工过程中均存在保留现象。生物信息学分析结果表明:草菇的GPx01序列具备完整的谷胱甘肽过氧化物酶保守结构域;系统发育树显示,担子菌与子囊菌的GPx分别聚在了2个不同的分支上,草菇GPx01与双孢蘑菇亲缘关系较近并与其他伞菌目的真菌聚在1个分支上。另外,由内含子保留所产生的氨基酸序列均出现了不同程度的功能域缺失,这将导致谷胱甘肽过氧化物酶的失活。表达谱分析结果表明:vv-gpx01在整个草菇生长阶段都有表达,但表达量存在差异。推测,草菇GPx01可能通过可变剪接产生不同的转录本,通过调节不同转录本的表达水平来调控基因功能域的翻译水平及空间构型,最终实现酶活性的调节。     

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌cry1Aa19基因的克隆、表达及杀虫活性分析

研究根据cry1Aa类基因的全长序列设计全长引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株LS-R-21的基因组DNA为模板扩增出片段大小为3 600 bp的cry1Aa的全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pEB相连接获得含有cry1Aa全长基因的重组质粒pEB-cry1Aa,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,诱导表达出132 ku的蛋白。该蛋白由1 175个氨基酸组成,其分子质量为132.9964 ku。该基因核苷酸序列已在GenBank中登录,登录号为HQ685121,并且被国际基因命名委员会正式命名为cry1Aa19。杀虫活性测定结果表明,cry1Aa对小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50为1.18μg.mL-1。该基因的获得将为害虫抗性研究及高效工程菌的构建提供了重要的试验材料。     

蜜蜂TPI基因克隆与生物信息学预测(英文)

[目的]克隆蜜蜂(Apis mellifera)TPI基因,并进行生物信息学预测。[方法]利用电子克隆方法获得蜜蜂磷酸甘油醛异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白的等电点、疏水性/亲水性、二级结构等进行了预测。[结果]蜜蜂TPI基因全长为1768bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),所编码蛋白的等电点为8.515。二级结构预测表明TPI蛋白属于α/β蛋白。[结论]利用蜜蜂表达序列标签数据库(EST)电子克隆蜜蜂新基因的研究工作有一定的现实意义,为进一步在分子水平研究蜜蜂提供更多的参考。     

犬瘟热病毒扬州分离株融合蛋白F和附着蛋白H基因的序列分析

根据Genbank犬瘟热病毒(CDV)毒株序列分别设计融合蛋白F和附着蛋白H全基因的2对引物,以2个CDV扬州分离株(CDV-YZ0101、CDV-YZ0102)为模板RT-PCR扩增出H基因和F基因2个片段,将其克隆进pGEM-Teasy载体,并进行序列分析.结果表明H基因的开放阅读框架(ORF)为1 824 bp,2种分离株间核苷酸和编码氨基酸同源性达98%左右,与中国长春分离株、美国、日本分离株的同源性分别为96%、93%～95%和90%～91%.氨基酸分析显示扬州分离株与其他分离株的H蛋白有8～9个可能的天冬酰胺糖基化位点,而OP-CDV疫苗株只有4个类似位点.扬州分离株与长春分离株同属一个系,与美国、日本分离毒株以及疫苗株相比,均存在着明显的差异.F基因ORF为1 989 bp,不同毒株间的核苷酸及编码氨基酸差异主要表现在信号肽区域,而编码的F0前体蛋白表现出较高同源性(97%～99%),且所有的13个半胱氨酸残基、4个可能的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区域均完全一致.因此CDV F与H蛋白基因相比有很高的同源性,证明中国分离株与国外参考株有差异.     

Molecular Identification and Characterization of Cryptosporidium spp. from Mainland China

Three isolates of the genus Cryptosporidium, namely, Guangdong isolate, Anhui isolate and Jiangsu isolate from Mainland China, were identified and characterized genetically utilizing nuclear DNA regions of the small subunit of ribosomal RNA (SSU rRNA) and heat shock protein 70 gene (HSP70) as genetic markers. These two regions were amplified by PCR from DNA extracted from oocysts and amplicons of approximately 290 bp and 450 bp were produced, respectively. The amplicons were purified, cloned and sequenced. Sequences of 446 bp and 290-292 bp were obtained for the SSU rRNA and HSP70 regions, respectively. The obtained SSU rRNA and HSP70 sequences representing the three Cryptosporidium isolates were compared with those retrieved from the DNA database. Genetic analyses using either DNA region revealed that members of Cryptosporidium formed two clusters, with C. parvum, C. wariri, C. felis and C. meleagridis clustered together, while C. andersoni, C. muris and C. serpentis belong to the other cluster. Based on SSU rRNA and HSP70 sequences, both Guangdong and Anhui isolates of Cryptosporidium were identified as C. muris of the calf genotype (i.e., C. andersoni), whereas the Jiangsu isolate was identified as C. parvum of the calf genotype. The findings of the present study should have important implications for the diagnosis and control of Cryptosporidium infections in both humans and animals in China.     

4株猪链球菌2型分离株主要毒力因子(MRP、EF)的全基因序列分析

猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌,溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)是其重要的2种毒力因子.参照GenBank上已发表的MRP和EF基因序列,设计引物,对4株国内SS2分离株进行MRP和EF全基因序列测定并进行分析.结果表明:4株SS2国内分离株MRP基因的完整开放阅读框(ORF)都为3 771 bp、编码1 256个氨基酸,EF基因的完整ORF都为2 532 bp,编码843个氨基酸;与国外参考株D282之间的MRP核苷酸和蛋白质的同源性都为99.9%,EF核苷酸的同源性为99.9%、蛋白质的同源性为99.5%～100.0%.     

北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花叶病毒CP基因序列分析及亚组鉴定

从宁夏和北京地区甜椒上分离到3个黄瓜花叶病毒分离物(宁夏分离物为CMV-NX1,NX2;北京分离物为CMV-BJ)并保存在普通烟上。从叶片中提取该病毒RNA,经RT-PCR扩增到780bp的全长CP基因的cDNA,PCR产物纯化并测序。2个宁夏分离物(NX1,NX2)核甘酸序列同源性为100%,它们为同一株系。与已报道的部分CMV株系的CP基因序列相比较,表明3个分离物与CMV亚组I同源关系比亚组II更密切,因而3个分离物都属于黄瓜花叶病毒亚组I,通过DAS-ELISA进一步验证它们都属于亚组I。     

伪狂犬病毒Fa株gB、gC、gD基因的克隆与序列分析

对猪伪狂犬病病毒闽A株(Fa株)gB、gC、gD基因进行了克隆和序列测定,结果表明:gB、gC、gD基因序列全长分别为2 745 bp、1464 bp、1 215 bp,编码914、487、404个氨基酸残基组成的多肽。序列分析结果显示:Fa株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9%~99.9%,氨基酸序列的同源性为91.4%~99.9%。不同PRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。基于gB、gC、gD基因的进化树分析表明,中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支,而日本分离株与欧美分离株归为另一个分支。在前一个分支里,闽A株与鄂A株的亲缘关系特别近,3个基因的同源率均在99.5%以上。在gB蛋白氨基酸序列全长上中国分离株(Ea株、Fa株)比欧美分离株多了1个氨基酸,氨基酸残基的突变主要集中在第50~100氨基酸。在gC基因序列第186~211 bp,Ea株、Fa株比欧美分离株多插入了21个碱基。在gD蛋白氨基酸序列全长上,Ea株、Fa株比其他分离株多了2~6个氨基酸。在gD基因序列第803~837 bp,Fa株核苷酸AGGCCC串联重复最多,达到7个。     

猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组及ORF2基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。     

烟青虫气味结合蛋白基因的克隆与序列分析

 根据已经报道的棉铃虫普通气味结合蛋白I（GOBP1）和性信息素结合蛋白（PBP）基因的cDNA序列，设计了2对引物，以烟青虫Helicoverpa assulta触角cDNA为模板，分别进行PCR扩增，获得2条特异性条带，约400 bp。将以上两条片段分别连接到T-easy载体上，获得重组子T-GOBP1-Hass和T-PBP-Hass。序列测定和结构分析表明，Hass-GOBP1开放阅读框全长441bp，编码147个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为17.2 kD和4.71。Hass-PBP开放阅读框全长405 bp，编码135个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为15.1 kD和5.2。Hass-GOBP1和Hass-PBP具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基，呈酸性。这2个基因已在GenBank中登记，序列号分别是AY864774和AY864775。     

猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析

从人泛素C端水解酶L1(UCH_L1)基因出发,在dbEST数据库中同源搜索,找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST(BM194679).通过电子克隆和进一步RT-PCR试验验证,获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列,其全长 1 105 bp,开放阅读框(ORF)位于60～728 bp,编码223个氨基酸.同源性分析结果表明,与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为91.2%和86.5%,蛋白质序列同源性均为96.6%.对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域,不含有信号肽,存在1个UCH_L1(pfam01088)保守结构域和多个磷酸化位点,属UCH_L1蛋白家族,故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因(登录号AY495532).