应用DIBA检测植物病毒的研究

 点免疫结合测试法(Dot Immunobinding Assay,DIBA)检测提纯TMV、PVY、CMV的最低检出率分别达到0.184ng/ml、1.28×10³ng/ml、0.056ng/ml。检测感病叶片粗汁液的最高稀释度依次为1:819,200、1:102,400、1:819,200。其中,检测TMV的最低检出率及最高稀释度分别比Hibi(1985)[1]的报道高544倍和100余倍。检测PVY粗汁液的最高稀释度比Banttari(1985)的报道高15倍[2]。HRP-IgG、抗血清在所使用的稀释度范围内(1:1000-8000、1:500-4000)对结果没有明显影响。但检测PVY时,随着血清稀释度的提高最低检出率明显下降。利用HRP-A代替HRP-IgG可以获得更为理想的检测效果。改进的DIBA(暂称为DSA-DIBA)检测TMV时未发现有任何假阳性反应。DIBA检测PVY、TuMV、PRSV-T揭示了它们相互间有效远缘的血清学相关性。实验表明,DIBA是检测植物病毒专化、快速、简便、灵敏、经济的新方法。     

一种快速简便检测马铃薯病毒的方法——病毒细菌协同凝集法(VBA)的研究

 在国内、外首次选用金黄色葡萄球菌(Staphylococc aureus)的No.180菌株用于病毒细菌协同凝集试验(Virobacterial agglutination test简称VBA)检测了来自马铃薯的4种不同形态粒子的病毒:马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯丫病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯卷叶病毒(PLRV),其灵敏度达2.7~6.1ng/ml,检出病汁液的最大稀释度达10⁴~10⁵(PLRV1:500),较国内、外采用的Cown I菌株的灵敏度提高5~10倍。与血清学方法相比,VBA在2~3分种内就可获得结果,无假阳性反应,其灵敏度显著高于间接酶联法和免疫电镜,而接近于A蛋白酶联法。经抗血清致敏的菌体在4℃下保存4个月,对VBA检测的灵敏度没有影响。用VBA对采自田间的93个马铃薯病样进行检测,它们大多受2~3种病毒(PVX、PVY及PLRV)的复合侵染;和用间接酶联法及鉴别寄主检测的结果趋向一致。室内和田间试验均表明VBA灵敏度高、特异性强、快速简便和经济,尤其适合在基层单位中推广应用。     

地高辛标记的cDNA探针检测烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒及马铃薯Y病毒

 根据已发表的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,分别以提取的TMV、CMV和PVY侵染的病叶总RNA为模板,反转录PCR进行体外扩增,分别得到长度为0.44、0.77、0.80 kb的目的片段,并克隆到pGEM-T easy质粒载体上,以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的双链DNA探针。以合成的探针通过斑点杂交技术检测烟草病叶总RNA和烟草病叶汁液。TMV、CMV和PVY的3种地高辛探针检测各自感染的烟草病叶总RNA的稀释低限分别为1:1000、1:10000、1:320,检测各自侵染烟草病汁液的最大稀释倍数分别为1:100、1:100、1:10,而每种探针与健康烟草和其它2种病毒的反应均为阴性。     

一种快速简便检测马铃薯病毒的方法——病毒细菌协同凝集法(VBA)的研究

在国内、外首次选用金黄色葡萄球菌(Staphylococc aureus)的No.180菌株用于病毒细菌协同凝集试验(Virobacterial agglutination test简称VBA)检测了来自马铃薯的4种不同形态粒子的病毒:马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯丫病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯卷叶病毒(PLRV),其灵敏度达2.7～6.1ng/ml,检出病汁液的最大稀释度达10~4～10~5(PLRV1:500),较国内、外采用的Cown I菌株的灵敏度提高5～10倍。与血清学方法相比,VBA在2～3分种内就可获得结果,无假阳性反应,其灵敏度显著高于间接酶联法和免疫电镜,而接近于A蛋白酶联法。经抗血清致敏的菌体在4℃下保存4个月,对VBA检测的灵敏度没有影响。用VBA对采自田间的93个马铃薯病样进行检测,它们大多受2～3种病毒(PVX、PVY及PLRV)的复合侵染;和用间接酶联法及鉴别寄主检测的结果趋向一致。室内和田间试验均表明VBA灵敏度高、特异性强、快速简便和经济,尤其适合在基层单位中推广应用。     

葡萄扇叶病毒的分离、鉴定、提纯及血清学研究

从表现扇叶和叶肉褪绿斑驳症状的先锋、葡萄园皇后和北醇的杂交单株中分离到3个与国外扇叶病毒(GFV)DIL分离物相似的GFY-DIL类似物。它们在昆诺藜、苋色藜、千日红和菜豆上表现症状。提纯病毒颗粒为直径约30nm的球形颗粒。在免疫双扩散试验中均与扇叶病毒抗血清形成完全融合的沉淀线。免疫电镜下病毒颗粒受扇叶病毒抗血清的修饰。利用三种间接异种动物抗体双夹心法和金黄色葡萄球菌蛋白A夹心酶联免疫吸附试验(PAS—ELISA)从感病的葡萄植株或组培苗叶片中检测了GF。间接异种动物抗休双夹心法能检测提纯GFV的最低浓度为1.6ng—8ng/ml。春季的芽和幼叶为合适的检测器官。     

A蛋白斑点免疫金染色和双抗体夹心酶联检测齿兰环斑病毒的比较

A蛋白斑点免疫金染色检测齿兰环斑病毒提纯病毒的灵敏度为1.56 ng/μl,检测病汁液的稀释倍数为640倍.同时采用碱性磷酸酯酶标记抗体IgG.IgG包被酶联板的浓度为1 μg/ml,酶标抗体以1 /1000稀释使用.DAS-ELISA技术检测ORSV提纯病毒的灵敏度为0.048 ng/μl,检测病汁液的稀释倍数为20480倍.     

实时荧光RT-PCR检测辣椒轻斑驳病毒的初步研究

本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明：该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。     

斑点免疫金和免疫金/银染色法检测烟草环斑病毒

在硝酸纤维素膜上进行的斑点免疫胶体金检测烟草环斑病毒技术已经建立.免疫金染色检测提纯病毒的灵敏度为25ng,检测病汁液可稀释10倍.使用免疫金/银染色则灵敏度更进一步提高.     

应用单克隆抗体检测大麦黄花叶病毒

作者应用已建立的大麦黄花叶病毒(BaYMV)的4F_(10)单克隆抗体杂交瘤细胞株,经小白鼠腹水生产单克隆抗体,用过碘酸钠法制备了辣根过氧化物酶标记的酶标单克隆抗体。并由此建立了检测大麦黄花叶病毒的标准的双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)。其检测提纯病毒的灵敏度为3.0μg/ml左右,感病大麦叶片汁液的最大稀释度为1:2560,病茎稀释度为1:160。对采自我国7个主要BaYMV发病区感病的样品进行了检测,绝大多数均显示强阳性,只有宝山样品例外。本项试验为BaYMV诊断的标准试剂盒的建立进行了有益的尝试。     

应用巢式RT-PCR检测水仙退化病毒1

水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus,NDV）是水仙上发生较为严重的病毒之一。本文根据 NDV 已报道的外壳蛋白基因序列,设计特异性引物,以感病水仙的总 RNA 为模板,建立了快速检测 NDV 的巢式 RT-PCR 方法。结果表明,巢式 RT-PCR 具有良好的特异性和灵敏度,能够从感染 NDV 的水仙样品上扩增出与预期大小相符的特异性目的条带,同时与其他病毒无交叉反应;灵敏度测定结果表示,巢式 RT-PCR 灵敏度较高,是普通 RT-PCR 的104倍,当 RNA 稀释到109倍时仍能被检测到。本文建立的巢式 RT-PCR 为水仙上 NDV 的快速检测提供了技术参考依据。     

Detection and localization of viruses in orchids by tissue-print hybridization

A tissue-print hybridization assay for the detection and localization of viruses in orchids is described. Orchid leaves were cut transversely and the cut surfaces were printed on to nitrocellulose paper. Because orchid leaves are often succulent, there is excellent transfer of plant sap to the membrane, resulting in clear tissue prints. The nucleic acid on the nitrocellulose membrane was then hybridized to radio-labelled cDNAs of cymbidium mosaic virus (CyMV) and odontoglossum ringspot virus (ORSV), and the viruses were detected by autoradiography. The assay was able to detect as little as 20 pg of purified virus, which is 2–3 orders of magnitude more sensitive than the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for CyMV. When tissue prints derived from different parts of the plants were used for hybridization, the method was able to show the distribution of viruses within the plants. On the basis of its sensitivity and ease of use, this method should find wide application in the detection and localization of viruses in orchids as well as in other succulent plants.     

北京地区一种侵染菊花的线条病毒

 从北京地区菊花病毒病株上分离到一种线条状病毒CA分离物。经寄主范围,传播方式、汁液体外抗性,外壳旧白分子量、粒体大小和在细胞中产生的内含体研究结果分析,此病毒为Potyvirus成员,沉淀反应,免疫双扩散反应和免疫电镜技术检测证明CA分离物与PVY在清学相关性。CA分离物已制备抗血清和提纯IgG,并应用于品种菊组培苗脱毒检测工作。     

水稻锯齿叶矮缩病毒抗血清的制备及其应用

 采用人工接种发病的水稻锯齿叶矮缩病株茎叶的榨出液,以低速离心(4000rpm)结合聚乙二醇(PEG)的方法所得部分提纯的病毒,进行家兔免疫注射制备抗血清,结果以注射后3~4周的效价最高,可达1:4096,α-最适比值为1:13。应用这种方法制备成的水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)的抗血清,进行了水稻矮缩病毒(RDV)病株与RRSV病株的鉴别诊断和RRSV毒源寄主的检测。结果证明,具卷叶、缺刻的RDV病株确非RRSV复合感染所致。毒源寄主测定表明,在供试的7种田间常见杂草中,有5种表现为阳性反应;经生物学回接证实,5种中有蟋蟀草、水蜈蚣和游草3种能成功地将RRSV传给水稻而引起发病。     

Detection of two orchid viruses using quartz crystal microbalance-based DNA biosensors

ABSTRACT We have developed a piezoelectric DNA-sensor based on DNA-RNA hybridization for the detection of two orchid viruses, Cymbidium mosaic virus (CymMV) and Odontoglossum ringspot virus (ORSV). Specific oligonucleotide probes modified with a mercaptohexyl group at the 5'-phosphate end were directly immobilized onto 10-MHz AT-cut quartz crystal microbalance (QCM). QCMs coated with such oligonucleotide probes were exposed to test solutions containing viral RNA for hybridization. Various experimental conditions evaluated were (i) DNA probe coating concentration, (ii) sensitivity and specificity of the probes at different hybridization temperatures, and (iii) effects of incubation temperature on the hybridization time. The specific nucleotide probe-coated QCM-based DNA sensors were able to detect both CymMV and ORSV in quantities as low as approximately 1 ng in purified RNA preparations and 10 ng in the crude sap of infected orchids. This is the first application of a DNA biosensor for the detection of plant viruses.     

蚕豆萎蔫病毒ELISA检测系统建立及其应用

 从制备的蚕豆萎蔫病毒(BBWV)抗血清中提纯IgG,并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立了DAS-ELISA检测BBWV的方法。DAS-ELISA检测时包被IgG以26.9 μg/ml效果最好,HRP-IgG结合物以1800~11600效果最佳。DAS-ELISA检测BBWV病叶粗汁液的最大稀释度为1 320,检测提纯病毒的最低浓度为0.744 μg/ml。田间病样测定表明,BBWV在蚕豆、豌豆、豇豆、大豆、茄子和辣椒等作物上发生很普遍,在菜豆上也有零星发生,而在莴苣、芹菜、白菜、萝卜、花椰菜上未测到BBWV。DAS-ELISA检测结果与生物学检测结果基本相符,符合率达97.6%。     

生物素标记cDNA探针杂交检测梨树上3种潜隐病毒研究

 本研究合成了苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的生物素标记cDNA探针,对斑点杂交和免疫印迹杂交检测这3种病毒的效果进行了分析。以含ACLSV和ASGV克隆片段的大肠杆菌菌液为样品时,斑点杂交检测灵敏度分别为80 cfu/μL和50 cfu/μL。以离体培养砂梨植株为材料,采用斑点杂交法检测砂梨离体培养植株粗提液中的3种病毒,均产生强的杂交信号,且特异性好。比较斑点杂交和ELISA检测病毒含量相对较低的热处理再生植株中ASGV和ACLSV,结果表明斑点杂交具有较高的灵敏度。组织印迹杂交检测砂梨离体植株ASGV和ACLSV的结果显示,这2种病毒在离体植株的各部位均有分布,自基部至茎尖各部位印迹均产生很强的杂交信号。     

马铃薯Y病毒属三种病毒通用型单克隆抗体的鉴定

构建了马铃薯Y病毒属的大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus,CLYVV)的原核表达载体pET28-SMV CP、pET28-PVY CP和pET28-CLYVV CP,经IPTG诱导、表达和纯化,获得SMV、PVY和CLYVV的CP蛋白。采用ELISA方法,用9株实验室制备的单克隆抗体对含SMV、PVY、CLYVV的病毒汁液和纯化的重组CP蛋白进行检测分析。结果表明,9株单克隆抗体均识别SMV病毒,2D3、4F9、4G12和6E7单克隆抗体能够识别PVY病毒,4F9和4G12能够识别CLYVV病毒,但PVY、CLYVV病毒与抗体的亲和力低于SMV病毒;对于重组表达的衣壳蛋白:SMV、CLYVV与抗体2D3、4F9、4G12和6E7反应强烈,PVY与4F9和4G12抗体反应稍强。综上,本研究鉴定出能识别SMV、PVY、CLYVV的通用单克隆抗体4F9和4G12。