甘薯病毒病的研究Ⅰ甘薯羽状斑驳病毒的分离、鉴定

 本文从寄主范旧,蚜传特性、病毒颗粒形态、免疫电镜等方面对嫁接获得的甘薯羽状斑驳病毒廊坊分离物(SPFMV-LF)进行了鉴定,并和SPFMV-RC(美国株)进行了实验比较。SPFMV-LF易汁液摩擦传播和嫁接传播,并以蚜虫非持久性传播,SPFMV-LF系统侵染巴西牵牛(Ipomoea setosa)、牵牛(I.nil);不侵染Chenopodium quinoa、C.ama-ranticolor、Nicotiana benthamiana及其它烟草。尚未发现其局部斑寄主。SPFMV-LF及SPFMV-RC感染I.setosa后引起相似的症状,但感染I.nil后症状差别较大。病毒颗粒长860-830nm,经两次蔗糖垫超速离心从SPFMV-LF感染的I.setosa叶片提取病毒并在BALB/C小鼠中制备抗SPFMV-LF的腹水多克隆抗体,免疫电镜表明,SPFMV-LF的抗体和SPFMV-RC株系有反应。上述实验结果表明SPFMV-LE是SPFMV的一个株系,但不同于SPFMV-RC。     

甘薯羽状斑驳病毒的分离与提纯

 本文应用标准的甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)抗血清,通过两次蚜传,从徐薯-18、新大紫上得到一种病毒分离物。接种指示植物后这种分离物仅感染Ipomoea setosa、Ipomoea nil,不侵染Gomphrena globosa L.、Beta vulgaris L.、Nicotiana tabacum L.、Nicotiana glutionsa L.、Brassica pekinensis, Datura stramonium L.、Cucumis sativis L.、Brassica、juncea、Raphanus sativus、Phsalis floridana。此病毒分离物可用蚜传、摩擦接种、嫁接三种方式传播,稀释限点为10-5,体外存活期不到24小时,热灭活温度为60~65℃。蚜传这种分离物到 I.Setosa上,再嫁接到I. nil或I. setosa上扩大增殖,用0.2M pH7.2 PB^K进行粗提取,结合垫层超离心,最后经蔗糖密度梯度离心得到了高纯度的病毒的提纯物,OD260/280的比值为1.25,粒体长度主要集中在830~850nm之间。实验证明这种病毒分离物为甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)。病毒收量为64.3mg/kg感病组织。提纯病毒在电镜下任何视野都可见到多量的、密集成堆的病毒粒体。     

甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因的分子变异

应用单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)技术结合核苷酸序列测定的方法,对我国甘薯主产区11个省份的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因的分子变异情况进行了研究.结果表明,SPFMV CP基因的RT-PCR产物表现了较丰富的图谱类型,50个分离物共产生9种主要的SSCP带型;对显示不同带型的20个样品的CP基因进行了序列测定和进化树分析,CP基因核苷酸序列一致性为77.2％～99.9％.说明这些样品的SPFMV的CP基因存在较大的分子变异,可划分为EA、RC、O和C4个株系.     

甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用

根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单-RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法.该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型.灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×104、1.32×104拷贝/μL和2.47×104拷贝/μL.该方法可用于甘薯叶片和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具.     

PCR方法检测美人蕉黄斑驳病毒

美人蕉黄斑驳病毒病是危害美人蕉的重要病害之一,我国目前尚无该病发生的报道.本文以健康和感病植株为材料,进行总DNA的提取和PCR扩增,从感病植株中扩增出与目的片段大小相符的产物,而健康植株中则未扩增出.PCR扩增产物经克隆、测序后证实,与已报道的美人蕉黄斑驳病毒(Cannayellow mottle virus,CaYMV)序列同源性高达97%～99%.经优化反应条件,建立了稳定的美人蕉黄斑驳病毒PCR检测方法.     

中国甘薯病毒的血清学检测

 作者用4种甘薯病毒抗体(IgG),3种血清学方法(DAS-ELISA、Dot-blot-ELISA和ISEM)对北京,江苏、四川、山东四省(市)的253份甘薯病毒病样品进行了检测。结果表明:上述地区甘薯中普遍存在甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯潜隐病毒(SPLV),尚难确定是否存在甘薯轻斑驳病毒(SPMMV)和甘薯花叶菜花叶状病毒(Sweet Potato Caulimo-like Virus,SPCLV)。21%的显症样品同上述4种病毒的抗血清不产生反应,显示我国甘薯上尚存在其它病毒。用Dot blot-ELISA和ISEM检测甘薯病毒比用DAS-ELISA灵敏准确。     

利用转录增强技术检测草莓斑驳病毒

为了提高检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)的灵敏度和稳定性,探索转录增强技术检测SMoV。在SMoV基因组3′端非编码区的保守区域设计引物,利用带有T7启动子序列的引物进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),再利用T7RNA聚合酶对PCR产物进行体外转录,最后直接通过电泳检测转录产物。结果表明,利用转录增强技术可稳定检测SMoV,灵敏度高于常规RT-PCR;T7启动子序列加在正义引物或反义引物上都可以有效检测。     

香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备及检测应用

 用香石竹斑驳病毒(CarMV)免疫的BALB/c鼠脾细胞与Sp2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得5株能稳定传代且分泌抗CarMV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞,并分别制备它们的单克隆抗体腹水。5株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6,其中3G1、1B9、2A9和2F8的抗体类型及亚类均为IgG1,而2F₂为IgG3。Western-blot分析表明,5株单克隆抗体均与CarMV 38 kD的外壳蛋白亚基有特异性反应。利用2A9单抗建立的抗原包被的间接ELISA (ACP-ELISA)检测CarMV方法,病叶1:800倍稀释、提纯CarMV病毒浓度为1 ng/mL (绝对检测量为0.1 ng)时仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA对田间香石竹样品的检测表明,CarMV在香石竹上发病很普遍。     

香石竹斑驳病毒的鉴定和RT-PCR检测

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,电镜负染观察到直径为28～33nm的球状粒子。病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.70;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。通过以上实验结果 ,确定该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus ,CarMV)。根据该病毒的RNA序列设计引物 ,对病健材料进行了RT-PCR检测 ,结果从感病材料中扩增出大约600bp的特异片段 ,而健康植物无此扩增带。将PCR产物连接 pGEM-T-easy载体 ,转化大肠杆菌JM109,得到了含目的片段的重组子 ,经双脱氧序列分析 ,与Guilley报道的序列对应部分的核苷酸序列基本一致 (其同源性达96% ) ,最低检出病毒核酸含量为5ng ,表明应用RT-PCR检测香石竹斑驳病毒是可行的     

美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测方法的建立

本文以我国台湾进境美人蕉病株为材料,根据已报道的美人蕉黄斑驳病毒Canna yellow mottle virus(CaYMV)基因序列设计2对特异性引物(外侧引物1对、内侧引物1对),建立了巢式PCR快速检测CaYMV的方法,并对进境的50份美人蕉样品进行了检测。结果显示,该方法特异性强,且灵敏度高于常规PCR,是常规PCR的1 000倍,表明该方法能够实现对CaYMV的快速、准确、灵敏检测,适用于口岸快速检测CaYMV。     

应用DIBA检测植物病毒的研究

 点免疫结合测试法(Dot Immunobinding Assay,DIBA)检测提纯TMV、PVY、CMV的最低检出率分别达到0.184ng/ml、1.28×10³ng/ml、0.056ng/ml。检测感病叶片粗汁液的最高稀释度依次为1:819,200、1:102,400、1:819,200。其中,检测TMV的最低检出率及最高稀释度分别比Hibi(1985)[1]的报道高544倍和100余倍。检测PVY粗汁液的最高稀释度比Banttari(1985)的报道高15倍[2]。HRP-IgG、抗血清在所使用的稀释度范围内(1:1000-8000、1:500-4000)对结果没有明显影响。但检测PVY时,随着血清稀释度的提高最低检出率明显下降。利用HRP-A代替HRP-IgG可以获得更为理想的检测效果。改进的DIBA(暂称为DSA-DIBA)检测TMV时未发现有任何假阳性反应。DIBA检测PVY、TuMV、PRSV-T揭示了它们相互间有效远缘的血清学相关性。实验表明,DIBA是检测植物病毒专化、快速、简便、灵敏、经济的新方法。     

微波ELISA快速检测水稻条斑病菌的研究

 ELISA是植物病原细菌鉴定和检测中最常用的血清学方法之一。作为一种快速、灵敏和准确的检测和诊断手段,常规ELISA常因反应板的"边缘效应"而影响检测结果的重复性,而且还存在整个工作程序时间较长(8~12h)的缺点。     

检测植物病毒的三种血清学方法敏感性的比较

 以芋花叶病毒和豇豆花叶病毒为试验材料,进行了酶联免疫吸附试验,免疫吸附电子显微术和点免疫结合试验检测植物病毒的敏感性的研究。无论是检测感染组织粗汁液还是纯化的病毒,点免疫结合试验均优于酶联免疫吸附试验和免疫吸附电子显微术。在使用羟基吲(口乃木)磷酸盐和氮蓝四唑为碱性磷酸酶的底物时,点免疫结合试验检测纯化的豇豆花叶病毒的可测感度为0.35ng,芋花叶病毒为0.83ng。对三种检测植物病毒的血清学方法进行了比较,并讨论了点免疫结合试验的优点。     

酶联免疫吸附法(ELISA)检测豆类种传病毒的研究

本文介绍使用微量板酶联免疫吸附法(ELISA)检测TMV(杆状)、SMV(线状)、CMV(球状)、AMV(杆菌状多粒体)四种不同形态、不同分类组群的病毒。此法非常灵敏,能够检测病毒提纯液的最低浓度为7.6～10亳微克/毫升,也能检出稀释1563～10240倍病叶粗澄清液中的病毒,灵敏度比琼脂双扩散法高1000倍以上。 ELISA可以直接检出单粒种子中的病毒,而且可以分别检出单粒种子不同部位如大豆的种皮、种胚、胚乳及胚根中的病毒存在。该法适用于检测大量标样,对植物检疫来说,这是一个很好的方法。     

酶联免疫吸附法(ELISA)检测花生种子带毒的研究

 利用花生上分离到的花生轻斑驳病毒(PMMV),黄瓜花叶病毒CA株系(CMV-CA),花生矮化病毒Mi株系(PSV-Mi)所制备的抗血清,从中提取IgG、应用ELISA间接法检测花生种子,在花生种子中不程度地都检测出带有PMMV、CMV、PSV病毒,而且有复合带毒现象。经催芽的花生种子子叶、胚芽及胚根分别用PMMV和CMV免疫制备的抗体进行检测,花生的上述三部分均带有PMMV和CMV病毒,且胚芽中病毒量最高。萌发种子及未萌发种子的子叶无论从带毒率还是病毒含量上均看不出明显的差异。ELISA间接法由于直接利用商品酶标抗体,简化了试验程序,利于对种子带毒进行快速检测。     

应用免疫电镜技术检测植物病毒

免疫电镜技术是将免疫学与超微结构形态学相结合的一种新的检验技术。为了把此项新技术迅速应用到植物病毒检疫上去,我们做了一些工作,简报如下:一、抗血清和抗原制备:烟草坏死病毒(TNV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄不孕病毒(TAV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)和白三叶草花叶病毒(WCMV)的抗血清由农牧渔业部植检所血清室提供;马铃薯 x 病毒(PVX)和马铃薯 y 病毒(PVY)的抗血清由中国科学院微生物所提供,抗血清效价     

粉虱传双生病毒的TAS-ELISA及PCR快速检测

 利用粉虱传双生病毒(WTGs)多克隆抗体及单克隆抗体,建立了三抗体夹心ELISA (TAS-ELISA)检测WTGs的方法,并发现了单克隆抗体SCR18可广泛用于我国WTGs的检测。利用根据WTGs基因组上基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的引物,建立了PCR特异检测WTGs的方法。对田间病样的TAS-ELISA和PCR检测表明,粉虱传双生病毒在云南省烟草、番茄和南瓜上均存在,2种方法的测定结果是一致的。