褪黑激素的ELISA测定方法

褪黑激素是由动物脑部的松果体细胞在暗环境所分泌的吲哚类激素，它的前体是5-羟色胺(5-HT)。早在20世纪20年代，McCord和Allen观察到牛的松果体的提取物能使某种小蝌蚪皮肤黑色素发生凝聚反应而褪色变白，因而得名褪黑激素(Melatonin简MEL，MLT，MT)。直到1959年Lemer等才鉴定了它的化学结构：N-乙酰-5-甲氧基色胺。 之后随着对它研究的深入渐渐阐明了其化学特点，褪黑激素为色氨酸衍生的小分子，浅白色固体结晶，无电性激素。     

羊弓形虫病间接ELISA诊断方法的建立

为比较5种弓形虫抗原的诊断效果,建立实用的羊弓形虫病诊断方法,本研究制备了弓形虫速殖子全虫抗原和4个重组蛋白(GRA1、MIC3、MAG、BAG1),正交试验比较其免疫反应性,从中筛选出相对优势抗原并建立羊弓形虫病间接ELISA(iELISA)诊断方法,用于检测弓形虫特异的IgG抗体。研究结果表明：除BAG1外上述4种抗原均具有较好的免疫反应性,综合考虑选择致密颗粒蛋白1(GRA1)作为诊断抗原建立了GRA1-iELISA,其检测弓形虫抗体灵敏度大于1∶100(血清稀释度),且不与羊莫氏巴贝斯虫、吕氏泰勒虫、捻转血毛线虫阳性血清发生交叉反应,特异性良好;运用建立的方法和改良凝集试验分别对采自山羊屠宰场的80份血清样品进行检测,测得的弓形虫感染阳性率分别为28.75%(23/80)和31.25%(25/80),二者总符合率为82.5%。本研究建立的ELISA检测方法对羊弓形虫病的诊断以及商业化试剂盒的开发具有重要参考价值。     

褪黑激素植入物

褪黑激素植入物是用人工合成的褪黑激素(MT)制成的一种体内缓释植入物,可用特制的埋植器埋植于动物的皮下。该技术是国际毛皮兽养殖业公认的一项先进技术,于1985年首先在北美的毛皮兽养殖场应用。MT植入物在毛皮兽养殖业中的应用:(1)用于促进冬皮提前成熟。适时皮下埋植MT,成年毛皮兽(水貂、狐、貉)的冬皮可提前2~3个月成熟,当年生幼兽冬皮提前1个多月成熟。另外,埋植MT有增强动物免疫力的作用,使死亡率下降。(2)用于人工调控银狐和兰狐的繁殖季节(提前或延后),使之同步,以扩大高效益兰霜狐皮的生产规模。我国于1993年掌握了用国产化工…     

羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

为快速准确诊断和检测羊附红细胞体病,及时采取防治措施,建立了检测羊附红细胞体抗原的双抗夹心ELISA诊断方法。选取规模化养殖场羊,镜检附红细胞体红细胞感染率> 90%,无菌采取血液,分离羊附红细胞体抗原,制备纯化兔抗羊附红细胞体抗体,应用辣根过氧化物酶标记抗体,进行双抗体夹心ELISA试验。试验结果表明,双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:抗体最佳包被量为82.91 μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为7.81 μg/mL;而且与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌以及牛、猪、兔附红细胞体均不出现交叉反应,表明该方法具有良好的特异性,可用于羊附红细胞体病的诊断和群体检测。     

基于GAPDH重组蛋白建立羊肝片吸虫病间接ELISA检测方法

为了建立早期羊肝片吸虫病的血清学快速检测方法,本试验成功克隆并表达肝片吸虫GAPDH重组蛋白,Western blot结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原活性。用肝片吸虫GAPDH重组抗原包被,建立肝片吸虫病血清抗体的间接ELISA方法;随后优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时筛选其他反应条件。结果显示,间接ELISA方法批内和批间重复试验的最大变异系数均小于10%,GAPDH重组抗原与华枝睾吸虫、日本血吸虫和捻转血矛线虫阳性血清均无交叉反应。对来自黑龙江省各地区的96份羊血清进行检测,阳性率为16.67%(16/96)。结果表明本试验建立的方法具有良好的敏感性和特异性,能够为早期诊断羊肝片吸虫病提供参考。     

褪黑激素的研究进展

褪黑激素的研究进展姚丽娟，李华锋，程瑞禾（南京农业大学动物科技学院２１００９５；山东六和集团有限公司２６６０７１）Ｎ－乙酰－５－甲氧色胺（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－５－ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ），即裉黑激素（ｍｅｌａｔｏｍｎ，ＭＥＬ），是松果腺细胞...     

检测绵羊衣原体流产菌株血清抗体的间接ELISA建立和评价

本文建立了用于检测鹦鹉热衣原体流产菌株的间接ＥＬＩＳＡ方法。ＥＬＩＳＡ和ＭＩＦ法联合使用对来自有感染史的６个羊群的血清和４个已知非感染羊群的血清能作出准确的鉴别。     

褪黑激素RIA方法的建立及其在探索湖羊四季发情机理上的应用

运用Mannich的反应，将褪黑激素（MLT）与牛血清白蛋白（BSA）连结，制备MLT完全抗原。MLT与BSA连结比为12：1。将此完全抗原免疫5只雄兔，制备特异性抗体；将MLT用^125I标记，薄层层析筛选标记物，制备高纯度的放射性标记物，建立竞争性MLT－RIA法。本法可测范围为15．31－1500pg，灵敏度为每管15．31pg，批内变异系数6．7％，批间变异系数14．8％。用此法测定夏至时考力代羊昼夜血样，测定结果与国外基本一致；测定夏至时湖羊昼夜血样，发现湖羊MLT分泌有其特殊性，即血液MLT水平呈明显的昼夜变化；白天为100ng/L左右，而黑暗开始时，MLT水平迅速上升，在20：00－次日8：00处于高水平，最大值为1100ng/L左右。     

褪黑素受体MT1和MT2在绵羊胃中的分布及表达

【目的】应用分子生物学技术探究绵羊不同胃室组织褪黑素(MT)特异性膜受体MT1和MT2的分布规律及表达模式,以初步探明绵羊不同胃室组织褪黑素调节胃消化的生物效应机制。【方法】采集绵羊瘤胃背囊、瘤胃腹囊、网胃、瓣胃和皱胃5个组织部位,用ELISA、实时荧光定量PCR、免疫组化和Western blotting方法检测褪黑素特异性膜受体MT1和MT2在绵羊胃组织不同部位的分布规律及表达模式。【结果】ELISA结果显示,绵羊各胃组织中均含有褪黑素,且皱胃中褪黑素含量最高,瓣胃次之,瘤胃背囊、瘤胃腹囊和网胃中均较低。实时荧光定量PCR结果显示,MT1和MT2基因mRNA在皱胃中含量均最高,其次是瘤胃腹囊,在瘤胃背囊和网胃中含量较低。免疫组化结果显示,MT1和MT2蛋白在绵羊各胃组织中均有分布,主要表达于各胃组织的黏膜层,且在皱胃腺体中的分布呈从底部到颈部逐渐增多的趋势。Western blotting结果显示,MT1和MT2蛋白在网胃中表达均最高,瓣胃次之,在瘤胃背囊、瘤胃腹囊和皱胃中表达均较低。【结论】褪黑素在绵羊各胃组织中差异化表达从而发挥多样性生理功能,可能通过与胃组织上特异性受体MT1和MT2结合,通过信号传导系统而调控前胃受食糜刺激后发生反刍生理过程。     

马立克病肿瘤相关抗原间接ELISA检测方法的建立

用自制并纯化的马立克病肿瘤相关表面抗原（MATSA）免疫SPF级BALB／c小鼠制备阳性对照抗体，以SPF级BALB／c小鼠血清为阴性对照抗体，筛选间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。结果，包被液为0．1mol／L pH9．6的碳酸盐缓冲液，抗原包被浓度为4μg／mL，封闭液为含10g／LBSA的PBST，抗血清稀释比例为1：800，酶标抗体稀释比例为1：1200，酶标抗体作用时间为37℃温育45min，底物作用时问为37℃温育15min，终止液为2mol／LH2SO4，洗涤4次，每次1min为最佳反应条件。将建立的方法应用于MATSA单克隆抗体研制过程中阳性克隆的筛选，成功获得了MATSA的单克隆抗体，表明该优化条件为间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。     

鸡肉中硝基咪唑类药物残留ELISA检测试剂盒的研制

分别利用戊二酸酐法和碳化二亚胺法合成半抗原和免疫抗原免疫动物,制备特异性强的单克隆抗体.在筛选硝基咪唑类单克隆抗体的基础上,建立ELISA检测方法,并研制出对鸡肉中硝基咪唑类药物残留检测试剂盒.试剂盒最低检测限为0.04μg/kg,样本添加回收率为69.4%～107.5%,批内变异系数为7.8%～14.6%,批间变异系数为10.90%～16.5%.该方法的建立为硝基咪唑类药物残留的检测提供了便捷、准确的分析检测手段.     

猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立

将RT—PCR方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，先建立猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV）的RT—PCR方法，用地高辛标记RT—PCR产物；再建立CSFV的PCR—ELISA方法，用生物素标记的探针在链亲和素包被的微量板孔中杂交捕获地高辛标记的PCR产物，最后进行免疫显色得出结果。试验主要对RT—PCRELISA的各种反应条件进行了优化，确定了1mg／L的链亲和素、50μg／L生物素标记的探针、1：3000抗地高辛的过氧化物酶、37C杂交2h等为最适反应条件。该方法的敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测高100倍以上，克服了组织样品中CSFV含量少而难以检测的困难，为猪瘟的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。     

不同绵羊品种褪黑激素的季节性及昼夜变化规律研究

系统研究了小尾寒羊、同羊、滩羊血液褪黑激素在春分、夏至、秋分时的昼夜变化规律,发现绵羊血液中褪黑激素存在着明显的季节性变化,在春分和秋分时平均含量相对较低,在夏至时明显升高。在夏至和秋分时,小尾寒羊和同羊血液中褪黑激素比滩羊低,在春分时,小尾寒羊褪黑激素比同羊和滩羊高。     

猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的PRV抗原为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测PRV血清抗体的间接ELISA诊断方法。标定抗原的最佳包被量为0.802μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为60min,判定标准为OD 450nm值大于0.357为阳性,小于0.296为阴性,在0.296与0.357之间为可疑。该方法检测其他6种常见猪病病毒(CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV)的阳性血清均为阴性;与商品化ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.0%、87.1%、92.3%。本研究建立的PRV间接ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV免疫猪群抗体监测、快速诊断和PR流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

Measurement of progesterone in sheep using a commercial ELISA kit for human plasma

Determination of serum or plasma progesterone (P4) concentrations is important to recognize pregnant and non-pregnant ewes, and also to predict the number of carried lambs. The 2 most common methodologies for the detection of plasma P4 are radioimmunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (EIA). RIA is very expensive, and not all laboratories are equipped to perform this test; EIA is commercially available for human use, but only a few companies produce species-specific kits, which are expensive. We verified for ovine plasma a less expensive and easily available ELISA kit (DiaMetra) designed to quantify P4 in humans. Pools of ovine and human plasma were used to compare repeatability, accuracy, sensitivity, and stability of P4 measured by the DiaMetra kit. Repeatability data were within 15%, and accuracy values were ~90% for both plasma matrices. Stability data showed a loss of <20% for freeze–thaw and <30% for 30-d storage. All parameters were acceptable under international guidelines for method validation. The human ELISA kit was used successfully to quantify plasma P4 in 26 ewes during pregnancy until delivery. P4 concentrations were also correlated with the number of carried lambs.     

ELISA检测IBV抗体方法的建立和标化

用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化传染性支气管炎病毒（IBV）作抗原，建立了检测IBV抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），特异性和重复性良好。已包放好抗原的ELISA板于—20℃保存5个月，不影响检验结果。     

褪黑素单克隆抗体的制备

褪黑素（MT）广泛存在于哺乳动物体内,是一种常见的吲哚类物质,可起到清除自由基、调节免疫、调节神经等作用。本文使用褪黑素-OVA作为免疫原,免疫5 只BALB/c小鼠,5 次免疫后采血检测,通过间接ELISA方法确定抗血清针对褪黑素-OVA的滴度。经ELISA筛选,最终获得5 株可稳定表达褪黑素抗体的单克隆细胞株（3G3B2、3G3C7、3G3D1、3G3F4、3G3G3）。纯化后抗体浓度为0.28 mg/mL,经测定,褪黑素单克隆抗体滴度可达1∶64 000,为进一步开发褪黑素的快速检测方法奠定了材料基础。