烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

    为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein, Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3 h后,使用终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4 h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66 kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.     

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

[目的]提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量.[方法]研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST - CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST - Sepharose 4B亲和层析柱对GST - CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定.[结果]大肠杆菌BL21 (DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600 =1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8h,GST - CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL.[结论]确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础.     

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因表达条件的优化

将已构建并测序正确的含有牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的pGEX-4T—P23转化菌用IPTG进行诱导表达,经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为46．0ku的融合蛋白．根据SDS—PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件,结果显示诱导时机和时间是影响表达的主要因素,诱导温度和IPTG浓度次之;确定最佳诱导时机为转接种后2．0h,最佳诱导温度34℃,最佳诱导时间6．0h,最适IPTG浓度0．08mmol／L．表达产物主要以包涵体存在,在优化条件下融合蛋白的表达量经Bandscan5．0软件分析约占菌体总蛋白的31．7％．     

牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

[目的与方法]以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD<,450>≥0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15;.Tams1间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与环形泰勒虫病巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]建立的Tams1间接ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法,为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

牛瑟氏泰勒虫P23主要表面蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达。[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23,经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆入表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌。通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性。[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008-1.000 mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性。[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础。     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化

为了提高猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段在大肠杆菌中的表达量,研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对衣壳蛋白基因CP239片段融合蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基于37℃培养3.5 h后,采用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG在37℃、200r/min诱导培养4 h,pET32a-CP239融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-CP239融合蛋白的分子质量与预期大小一致,约为45.3 ku;Western blotting结果表明,pET32a-CP239融合蛋白可以与抗-HEV阳性血清发生特异性反应,并具有良好的反应原性,说明衣壳蛋白基因CP239片段蛋白得到正确表达。     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达条件优化、纯化及鉴定

为了将绿色荧光蛋白(GFP)引入大肠杆菌中表达并且进行蛋白的纯化,以提高GFP在大肠杆菌中的表达量,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究.将人工重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),研究大肠杆菌菌株在温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对HIS-GFP融合蛋白表达量的影响.结果:大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃培养下,D600为0.6～0.8,使用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG在15℃诱导培养12 h时,HIS-GFP融合蛋白表达量最高,表达的HIS-GFP融合蛋白可占细菌总蛋白的40％以上.用Ni-IDA亲和层析柱对HIS-GFP融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析表明HIS-GFP融合蛋白大小约为68 ku,与预计的分子量大小一致,Western blotting分析表明其能与Anti-HIS单克隆抗体起特异性反应.     

犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

[目的]为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性.[方法]在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IFTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Westem-blot检测重组蛋白的生物活性.[结果]大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合.[结论]在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础.     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

人基质蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域原核表达优化

用构建的人基质蛋白酶-2（MMP-2）类血红素结构域原核表达载体PET25b—PEX转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性菌落LB液体培养基培养，异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达产生的表达蛋白，大小约29kD，与预期大小相符。设置不同的IPTG诱导终浓度，诱导时间，诱导时菌液OD值和LB液体培养基的pH值，SDS-PAGE电泳和软件分析发现，当IPTG浓度为0．7mmol／L，诱导4h，诱导时菌液OD值为0．7时，实验能获得最高的PEX蛋白表达；5L大规模培养时，LB培养基pH值为7．5时，可获得较高的重组PEX蛋白表达。     

猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白和N蛋白在大肠杆菌中的优化表达和纯化

采用不同的培养基、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导剂浓度以及诱导菌浓度等大肠杆菌表达条件,进行了融合蛋白HIS-GP5和HIS-N的优化表达和纯化研究.结果表明:重组质粒转化菌E.coli BL21(DE3)在含0.3 mmol/L IPTG的TB培养基中,20℃诱导表达14 h时融合蛋白表达量最高,经纯化得到了HIS-GP5和HIS-N融合蛋白.SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的蛋白纯度大于95%.     

新疆牛环形泰勒虫虫病的流行病学调查

[目的]2006～2008年全疆14个地州的牛环形泰勒虫病流行病学调查.[方法]使用已建立的牛环形泰勒虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST - Tams1作为抗原.[结果](1)牛环形泰勒虫病仍是新疆牛梨形病的主要病原.在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清31份,感染率为11.15;.2007年,在532份牛血清样品中检出阳性血清61份,感染率为11.47;.在2008年的530份牛血清中检出阳性血清61份,感染率为11.51;.(2)2008年,在地方流行性疫病区牛环形泰勒虫感染率高达24;.[结论]新疆牛环形泰勒虫病的特点是疫区分布广,感染率居高不下,保持在11;以上,对动物和人类构成一定的威胁.这是新疆首次利用血清学方法对全疆牛环形泰勒虫病进行大规模的流行病学调查.     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中稳定表达条件的优化及纯化

将狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因按正确的读码框克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-1中,转化至大肠杆菌Rosetta株,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,相对分子量约为82 kD,与预期大小一致。Western-blot检测结果表明,融合蛋白能与多克隆阳性血清发生特异性反应。为获取大量ELISA包被用核蛋白,试验还借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、菌密度I、PTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。结果表明:27~32℃,OD5500.3~0.4,IPTG 0.06 mmol/L、诱导至OD550值不再增加时为最佳诱导表达条件。优化后经扫描分析显示,所表达融合蛋白占菌体总蛋白的20%以上。经包涵体纯化和亲和层析纯化,可获得纯度较高的GST融合蛋白。     

生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达及纯化

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和 IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明：在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16 ℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25 ℃和0.4 mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,但BL21(DE3)菌种中的GST–AtTIR1表达量很低。利用GST SefiroseTM resin亲和树脂对表达的蛋白进行纯化,获得了较纯的AtTIR1和IAA28蛋白。     

油松苯丙氨酸解氨酶基因原核表达载体的构建及表达分析

利用基因重组技术,以油松PAL基因(TaPAL) CDS区(2 157 bp)作为外源基因的同源重组片段,构建了pET-28a-TaPAL重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达并进行分析.经SDS-PAGE电泳检测,在分子量80 KD处获得一条特异蛋白的表达条带,且其大小与预期相符.在温度28℃,IPTG浓度1.5 mmol· L-1,时间3h条件下,重组质粒的表达量最大.可溶性分析表明,在最佳诱导条件下,该蛋白主要以包涵体形式存在.粗酶活性测定表明,粗酶(在20℃、IPTG浓度1 mm01·L-1条件下诱导10 h)比活力为55.3μmol·min-1·gpro-1,即55.3U·g-1.构建的pET-28a-TaPAL重组载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出具有生物活性的融合蛋白.     

海洋双RNA病毒VP2e基因的克隆和表达

从海洋双RNA病毒(MABV)Y-6毒株基因组中克隆到VP2 e基因,将其连接到GST融合表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中表达,并对其表达条件进行了优化。通过温度和诱导物浓度优化试验,经SDS-PAGE和Western-Blot检测表明,在温度为37℃、IPTG浓度为0.1mmol/L时,表达的融合蛋白含量最高,占细菌总蛋白的28.6%。     

白菜BcMF2基因在大肠杆菌中的高效表达

通过PCR方法扩增BcMF2cDNA完整的编码区序列,构建pETBcMF2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达;SDSPAGE电泳检测发现在70kD处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致,同时发现,其阳性克隆在30℃和IPTG终浓度为0.4～1.0mmol·L-1时诱导6h,均能获得较高的表达量。     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

泰勒焦虫表面抗原Tams1、SPAG1和TaSP基因的克隆与表达

[目的]以真核表达系统串联表达环形泰勒焦虫表面抗原Tams1、SPAG1和TaSP的高免疫原性区片段,为研究焦虫重组串联蛋白免疫原性奠定基础.[方法]以悬浮培养泰勒焦虫细胞为材料,利用SOEing-PCR方法将Tams1、SPAG1和TaSP蛋白高免疫原性区基因通过柔性氨基酸串联嵌合在乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的主要免疫优势区,构建模拟表位-HBc嵌合蛋白真核表达质粒,转染BHK-21细胞,通过Western-Blot检测目的基因表达产物.[结果]Western-Blot分析显示,阳性质粒转染BHK-21细胞裂解产物在硝酸纤维素膜上呈现特异性条带,大小与预期分子量相当;正常BHK-21细胞裂解产物未呈现相应的条带.[结论]重组嵌合蛋白在真核表达系统中成功表达.     

抗真菌活性肽段CGA-N46的免疫学鉴定及其高效表达条件研究

[目的]嗜铬粒蛋白Chromogranin AN端31-76位氨基酸组成的多肽CGA-N46具有较强的抗真菌活性,对其表达条件进行研究具有重要意义。[方法]将CGA-N46基因重组大肠杆菌BL21(DE3,pET-N46)接种于含有氨苄青霉素的2×YT培养基中,于37℃、230r/min振荡培养3 h后加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L,25℃条件下诱导6 h,离心收集菌体进行SDS-PAGE蛋白电泳。利用抗6-His的单克隆抗体进行免疫印迹,结果有免疫印迹条带,但表达量不高。鉴于此,对CGA-N46基因的表达条件进行了优化。[结果]在37℃下培养3 h后加入IPTG25℃诱导9 h,目的蛋白表达量较高,当诱导剂IPTG的浓度超过0.4 mmol/L时,其浓度的改变对目的蛋白的表达没有多大影响。