苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因工程研究进展

概述苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的结构、功能及其基因分类,综述苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的基因工程研究及应用。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的研究进展

从Bt基因的分类、结构和特性、杀虫机理、在农业上的应用及昆虫对Bt产生抗性的机制等方面进行了论述。     

苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4杀虫晶体蛋白基因分析

利用稀释平板培养法从连云港地区的土壤中分离了一株苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4,通过PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE方法分析了此菌株中cry基因类型和表达蛋白。结果表明:该菌株中含有cry1Aa基因型,同时表达130~140kD的蛋白;但EcoRⅠ和PstⅠ酶切结果不同于正常的cry1Aa基因,实验中利用生物信息学方法设计的cry1Aa基因特异引物对扩增后也证明含有cry1Aa基因。室内生测结果显示,该菌株对重要的农业害虫甜菜夜蛾、菜青虫等均有较高的杀虫毒力。     

苏云金芽孢杆菌的生物活性物质及其蛋白基因

苏云金芽孢杆菌（Bt)研究的热点正逐步转向新资源的收集和开发，本文就其杀虫，抑菌、抑癌细胞等6种主要生物活性物质，蛋白及其编码基因作一回顾与展望。     

苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因crylA的克隆及特征分析

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种(Bacillus tburingiensis subsp sotto)对鳞翅目幼虫有高毒力。根据crylA类基因序列设计特异引物，应用PCR技术从该茁株中扩增得到一大小约为3．6kL的DNA片段。将获得的片段克隆至pGEM7zf中并转化大肠杆菌DH5α。在ABI PRISM377自动测序仪上对其5’及3’端进行部分测字，结果表明其核苷酸序列与crylA基因高度同源。     

河北省不同生态区的苏云金芽孢杆菌cry基因多样性研究

为了明确苏云金芽孢杆菌在河北省不同生态区的分布特点和cry基因的多样性,研究从河北省不同生态地区(阜平天生桥、涞源白石山、安新白洋淀、保定郊区大田和安国中草药田)采集土样806份,采用温度-抗生素法分离获得Bt菌株46株,利用PCR-RFLP技术对46株Bt进行了基因型研究,结果表明从这些菌株中发现7种不同的基因型cry1、cry2、cry3、cry4、cry8、cry30和cry32,11株未鉴定出基因型;通过SDS-PAGE分析发现这些菌株主要表达130-150kDa、70-80kDa、60kDa和30kDa蛋白,实验结果说明了苏云金芽孢杆菌在河北省不同生态区均有分布,并且其cry基因类型是复杂多样的。     

亚致死剂量苏云金杆菌蜡螟亚种晶体蛋白对大蜡螟幼虫肠道消化…

本文研究了亚致死剂量苏云金杆菌蜡螟亚种晶体蛋白对大蜡螟幼虫肠道消化酶（蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶）活性的影响。结果表明，经晶体蛋白处理后大蜡螟幼虫肠道蛋白酶和胰蛋白酶比活力均下降。电泳分析表明，演粉酶两种同功酶的活力均增强，蛋白酶各同功酶活力均下降。     

苏云金芽胞杆菌及其杀虫晶体蛋白基因资源的研究进展

介绍了苏云金芽胞杆菌的一般特性、分类鉴定与分布以及其杀虫晶体蛋白基因的分类、在苏云金芽胞杆菌中的定位及鉴定方法,并对苏云金芽胞杆菌及其基因资源的应用前景作了展望.     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白对棉铃虫活性分析

利用已克隆的5种Bt Cry基因Cry2Ab4、Cry1Ia8、Cry1Ie1、Cry1Ca7、Cry1Cb2和1种野生菌株HD-73(Cry1Ac)表达的6种Bt Cry杀虫晶体蛋白,对棉铃虫进行生物活性分析,并将Cry1Ac杀虫晶体蛋白分别与其它5种Cry蛋白按1:1的比例组合,对棉铃虫进行生物活性测定。结果表明,单独使用Cry1Ac时对棉铃虫活性最高,LC50为3.16μg·mL-1,其次为Cry2Ab4。Cry1Ac与Cry2Ab4组合对棉铃虫也有较高的活性,LC50为48.70μg·mL-1,该组合对棉铃虫的共毒系数为1.21,有相加作用。Cry1Ac与这5种蛋白的组合对棉铃虫都有较高的毒力。     

苏云金杆菌以色列亚种L-10菌株培养基优化研究

利用单因素筛选和正交试验,对苏云金杆菌以色列亚种Bti-L-10高毒菌株的发酵培养基进行了优化,得到其最佳培养基配方为:淀粉3%,氮源B 0.50%,氮源C 0.75%,氮源D 4.00%,氮源G 1.00%.通过200 L和40 000 L发酵罐分别发酵,发酵液效价分别为379 ITU/mg和327 ITU/mg,发...     

苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种几丁质内切酶基因的生物信息学分析

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp kurstaki）基因组DNA为模板,利用1对特异性引物通过Touchdown PCR方法扩增了长为2576bp的几丁质酶kchi基因序列（GenBank登录号：AY189740）。生物信息学分析发现：该序列包含1个完整的开放阅读框,编码688个氨基酸,推测是分子量约为75820。等电点pI=5．89的几丁质酶前体。序列和结构比较分析结果表明：Kchi属于几丁质内切酶,包括几丁质酶催化区、粘蛋白Ⅲ型同源区和几丁质结合区3个结构域,在N端还有1个分泌信号肽。除与胁巴基斯坦亚种几丁质酶同源性较低（相似性为61．3％）外,与Bt其他亚种的同源性都较高（≥92．0％）。     

1株广谱苏云金芽孢杆菌及其发酵条件的研究

从土壤中分离出几株广谱杀鳞翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌。其中杀虫效果最好的1株C-33血清型为H5，产生近方形和菱形的伴孢晶体，含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1C基因，产生144kDa和77kDa的晶体蛋白质。毒力生物测定证明C-33对棉铃虫及甜菜夜蛾有高毒力。对该天然广谱Bt菌株C-33进行了摇瓶发酵和小试发酵试验，结果表明其发酵性能良好。通过2L全自动罐发酵试验，优化了发酵培养基和发酵条件，发酵效价达到3400～3700IU／μl(棉铃虫)。     

高含量原粉生产菌株苏云金芽孢杆菌LX-7的研究

从土壤中分离的苏云金芽孢杆菌LX-7高毒力菌株,利用单因子筛选和正交试验,得到其最佳培养基配方(g/L)为:玉米淀粉30,氮源A 30,氮源D 15,氮源E 15,并对其发酵工艺和后处理工艺进行了优化,40 000 L发酵罐发酵制得原粉效价达到80 000 IU/mg以上,晶体蛋白含量达到13.2%.     

高毒力苏云金杆菌YN1-1的蛋白质特性及田间防效

[目的]为了调查对鳞翅目害虫具有高毒力苏云金杆菌YN1-1菌株的生物学特性.[方法]分析YN1-1菌株晶体蛋白的SDS-PAGE电泳图谱,调查YN1-1菌株对几种鳞翅目害虫的室内药效及田间防效.[结果]YN1-1菌株的伴孢晶体具菱形结构;其原毒素蛋白分子量为136 kDa,经胰蛋白酶处理后水解为63 kDa的活性毒素蛋白.室内药效试验结果,用YN1-1菌株处理小菜蛾与菜青虫时,其药效比商品苏云金杆菌(WP)更好;在田间防效上,YN1-1菌株的虫口减退率也比商品苏云金杆菌(WP)更高.[结论] YN1-1菌株具有优良的开发潜力.     

苏云金芽胞杆菌cry基因研究进展

从cry基因的分类、鉴定、遗传特性以及应用概况等4个方面综述了苏云金芽胞杆菌cry基因的研究进展,并对cry基因的研究进行展望。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的研究

 通过对Cry1Ba3蛋白序列的分析，以及与已知Cry蛋白比较，设计了6对特异性引物，PCR扩增获得6种不同长度的cry1Ba3基因片段。将这些基因片段克隆到pET-21b载体上，导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，最终得到6种不同长度的Cry1Ba3蛋白片段。采用浸叶法检测这些蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性，研究结果表明含有第1-685位和含有第22-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒性，与全长Cry1Ba3蛋白相比，没有改变；含有第54-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒力明显降低；而含有第22-627位和含有第85-655位氨基酸的蛋白片段完全丧失了对小菜蛾的活性。上述结果表明Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的最小活性区在第22-655位氨基酸之间。     

杀虫晶体蛋白基因CrylAc在生防菌B-916中的表达

枯草芽孢杆菌生防菌B-916对水稻纹枯病和稻曲病具有良好的防治效果，为拓宽其防治范围，兼治病虫害，本研究采用B-916内源芽孢形成期特异表达启动子成功实现了杀虫晶体蛋白基因CrylAc在野生型生防菌B-916的高效表达，成功构建了兼治水稻病、虫害的工程菌E-916。经SDS—PAGE电泳分析，异源CrylAc基因在对数生长后期其表达产物杀虫晶体蛋白占到胞内总蛋白的28％。杀虫和抑菌试验结果表明构建的工程菌对水稻二化螟具有杀虫活性，且保持了其原有对水稻纹枯病的拮抗性能。构建的工程菌具有良好的分离稳定性，连续培养25h，稳定性高于95％；连续培养50h稳定性高于70％；连续稀释培养50h，质粒丢失频率为每代小于10^-3个。     

绿色荧光蛋白基因gfp在苏云金芽胞杆菌中表达的初步研究

 将携带蜡状芽胞杆菌特异启动子的gfpmut3a基因克隆到穿梭载体pHT30 4后 ,电转化至苏云金芽胞杆菌BMB171,CryB、IPS78 11、4Q7、HD 80 2 1中。通过荧光显微镜和Bio assayReader对含重组质粒pGFP 30 4的 5个受体菌分别进行荧光检测及定量分析。结果表明 ,gfpmut3a基因仅在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171、CryB、IPS78 11、4Q7中表达并可检测得到菌体发光 ,并建立了一套适合于苏云金芽胞杆菌的GFP标记与检测方法。