指导外源基因在动物乳腺特异性表达载体的构建

为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用PCR法扩增了BLG 3'端含第6,7外显子及poly(A)加尾信号下游约200 bp的0.87 kb片断.以山羊BLG 5'的3.2 kb(含第1,2外显子)启动子,山羊BLG 3' 0.87 kb序列,鸡 -珠蛋白基因簇基因上游的 2.4~ 5.3 kb HindⅢ序列,绿色荧光蛋白GFP及原核载体pGEM-7zf构建了pGEM-7zf-GFP-MAR-5' BLG-3' BLG的乳腺特异性表达载体,将外源基因插入BLG 5'端EcoRⅠ位点,或许可能实现其在乳腺中位置独立性表达.     

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2重组鸡痘病毒的构建

含ＩＢＤＶ保护性抗原ＶＰ２的质粒,以ＳｐｈＩ消化,然后用Ｔ４噬菌体ＤＮＡ聚合酶将末端补平,产物纯化后再以ＳａｌＩ消化一次,经再次纯化后与ＳｍａＩ和ＳａｌＩ分步酶切的鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１相连,使唤基因顺向插入到载体Ｐ７５启动子下游,得到含ＩＢＤ ＶＰ２基因的重组插入载体ｐＦＧ ＶＰ２。     

小鼠乳汁中重组人乳铁蛋白的提取与抗菌活性的研究

本研究从人乳铁蛋白（hLF）cDNA转基因小鼠乳汁中提取重组人乳铁蛋白（rhLF）,并用提取的rhLF进行抗菌活性分析。收集了2个基因和2个品系的（PCL25和AP基因）转基因小鼠乳汁,采用凝胶过滤层析法从转基因小鼠乳汗中提取rhLF,提取物通过SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析,ELISA检测提取物中rhLF含量;按不同浓度rhLF作琼脂扩散抑制大肠杆菌、沙门氏菌试验。结果表明,通过凝胶过滤层析获得的PCl25和AP转基因小鼠乳汁中的rhLF分子量为78KDa,与天然人乳铁蛋白一致,rhLF对大肠杆菌、沙门氏菌均具有明显的抑菌作用。     

转基因小鼠乳汁中重组人乳铁蛋白的提取与抗菌活性分析

从人乳铁蛋白cDNA转基因小鼠(Mus musculus)中收集2个品系(PCL25和AP)的乳汁.采用凝胶过滤层析法提取重组人乳铁蛋白(rhLF).通过SDS-PAGE电泳.Western blot和ELISA鉴定并检测提取物中rhLF含量,按不同浓度rhLF作琼脂扩散抑制大肠杆菌(Eschenchia coil)和沙门氏菌(Salmonella)试验.结果表明,PCL25和AP转基因小鼠乳汁提取物中的rhLF含量为7-8 mg/mL;rhLF分子量为78 kD,与天然人乳铁蛋白分子量一致;对大肠杆菌和沙门氏菌均具有明显的抑菌作用.     

利用噬菌体随机肽库筛选传染性法氏囊病病毒VP2模拟表位

用纯化的4株传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2单克隆抗体(1B5,5D1,2H11和I4-4-3)筛选噬菌体随机12肽库,对40个克隆(10个单克隆噬菌斑×4株单克隆抗体)进行ELISA验证,获得32个阳性克隆,选20个阳性克隆(5个单克隆噬菌斑×4株单克隆抗体)进行DNA序列分析,确定了4个优势12肽为不同传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗原表位.这4个12肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与GenBank中传染性法氏囊病病毒、VP2的氨基酸序列相同之处,与单抗的结合可被VP2蛋白有效地抑制,推测可能是构象依赖性表位.将4个模拟表位串联表达后获得目的蛋白,经SDS-PAGE分析,目的蛋白占菌体总蛋白的20%,分子量30 kD.用多克隆抗体对目的蛋白进行免疫印迹分析,结果表明目的蛋白具有特异性和反应原性.试验结果提示:筛选的是传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2单抗的模拟表位.     

转基因小鼠生产过程的优化

以昆明小鼠作为制备转基因小鼠的供、受体，优化了转基因小鼠生产过程中的显微注射和移植过程，调整了对大小不同的DNA的注射浓度和受体鼠的选择标准。结果使转基因效率从10％上升到20％以上；并得出DNA的大小与注射浓度的最适结合点为大于10kb的DNA，浓度应控制在2～3μg／mL。     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

三价转基因抗病毒西瓜的培育

利用西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)外壳蛋白(CP)基因、西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)复制酶(NIb)基因和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)复制酶基因构建三价植物表达载体，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化西瓜(Cirrullus lanams)子叶外植体获得再生植株。经PCR和Southern-blot检测，证明目的基因成功地导入西瓜植株，并能够在后代植株中遗传，转化效率约为1．7‰。在温室和大田对T2、T3代转基因株系进行了病毒接种实验和抗病性筛选鉴定，转基因西瓜株系表现出感病、抗病、免疫和症状恢复等不同的类型。其中BHI-7株系的T2代植株对ZYMV和WMV的抗病能力普遍达到中等水平以上，并保持了受体西瓜品系原有的优良农艺性状。     

Bt汰选棉铃虫对转基因棉花的适应性研究

用Bt粉剂、转Bt基因棉叶汰选获得的低抗棉铃虫种群，在室内测定其对转Bt基因棉叶的适应性，结果表明两次选种群对转基因棉叶的反应有相同趋势。虽然两汰选种群在转基因棉叶上幼虫存活率比同源敏感种群提高，但存活幼虫体重、蛹重比取食常规棉叶的明显减轻，幼虫历期明显延长。比较抗、感种群在转基因棉花不同生长季节的生长，抗性种群化蛹率的提高，主要在转基因棉花生长后期，而在转基因棉花生长前期（6月下旬）开始取食的抗性初孵幼虫与敏感种群一样，仍不能化蛹，结果表明，室内用转Bt基因棉叶、Bt粉剂汰选的两低抗水平种群，在转基因棉花上适应性明显提高，但存活幼虫生长发育不正常。     

鸡传染性法氏囊病病毒毒力测定方法的改进及国内7个毒株毒力的测定

摘要: 准确衡量鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)毒力特征对研究IBDV毒力变异的分子基础、变异规律，以及影响IBDV毒力的相关分子生物学、病原生物学和细胞生物学机制有重要意义。但是，IBDV的毒力测定方法一直没有一个统一的标准。常规以SFP鸡和商品鸡的死亡率表示IBDV的毒力，但IBDV的定量方法和接种剂量并没有一个统一的标准。研究采用尿囊膜接种途径和灵敏度较高的双抗夹心ELISA方法，大幅度提高EID50定量的灵敏度，使EID50能够准确定量不同致病类型的毒株。SPF鸡和商品鸡的接种剂量根据Eterradossi的研究结果确定为2×103EID50。通过7株中国IBDV的毒力测定及相关分析，证明该方法灵敏度高，重复性好、通用性强, 有利于IBDV毒力测定方法的标准化和规范化。