利用响应面分析法优化贝莱斯芽孢杆菌TCS001的发酵条件

贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis TCS001是一种新型生防细菌,为了提高其生防作用,本文开展了培养基发酵条件优化研究。以TCS001发酵滤液对黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea的抑制率为因变量,先从NB、BPY、YT、BP、LB和SOB 6种基础发酵培养基中筛选最佳基础培养基,再利用Plackett-Burman (PB) 试验筛选出影响发酵滤液抑菌率的关键因素;通过最陡爬坡路径法确定主要影响因素的响应中心点,利用Box-Behnken设计和响应面分析法获得最优发酵条件;通过活体植株喷雾法测定发酵液对黄瓜灰霉病菌的抑制活性,进一步明确其优化效果。最终获得最佳基础培养基为NB培养基,发酵条件为:蛋白胨10.0 g,葡萄糖12.5 g,牛肉浸膏4.0 g,酵母粉1.0 g,蒸馏水1 000 mL,装液量 (体积分数) 40%,种子培养时间16 h,接种量 (体积分数) 3%,转速164 r/min,温度25 ℃,pH 7.0,发酵培养时间36 h。离体抑菌活性试验验证发现,优化培养的发酵滤液抑菌活性最强,抑制率达90.9%;活体盆栽抑菌试验表明,优化培养的发酵液对黄瓜灰霉病的病斑抑制率为74.7%,比优化前提高了36.9%。该结果为贝莱斯芽孢杆菌有效的活性产物分离提取及结构鉴定等后续研究提供了理论基础。     

‘赞皇枣’黑腐病菌拮抗芽胞杆菌的筛选及发酵条件优化

以‘赞皇枣’黑腐病主要病原菌链格孢菌［Alternaria alternata (Fries) Keissler］为靶标,对具有较强抗真菌活性的10株芽胞杆菌进行室内多重筛选,并采用二次回归正交旋转设计和单因素试验对筛选获得的目标菌分别进行发酵培养基优化和最佳发酵条件确立。结果表明：芽胞杆菌B07对靶标菌拮抗作用良好,活体拮抗抑菌带宽度达(8.00±0.50)mm,无菌发酵滤液抑菌圈直径为(24.44±1.37)mm,且有良好的持久性,具有开发应用价值;B07发酵的最优培养基为：红薯粉2 g/L,牛肉膏10 g/L,NaCl 10 g/L,MnSO4 ?0.02 g/L;最佳发酵条件为：种子液浓度1.5×107~2.0×108 cfu/mL时,接种量5%（V/V）,装液量40 mL/250 mL,原始pH7.0,发酵温度32 ℃,时间72 h。     

葡萄霜霉病菌拮抗放线菌PY-1发酵条件优化

为探讨暗黑链霉菌Streptomyces atratus PY-1液体摇瓶发酵条件,提高其活性次级代谢产物的产量,以菌体生物量和发酵液抑制葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola活性为指标,采用单因子试验和正交试验对菌株PY-1的最适发酵培养基成分及发酵条件进行优化。结果表明,菌株PY-1最适发酵培养基为玉米粉50 g/L、葡萄糖5 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化铵5 g/L、氯化钠 0.5 g/L;最佳发酵培养条件为培养温度28 ℃、培养时间5 d、初始pH 7.0、250 mL三角瓶装液量90 mL、接种量体积分数5%、摇床转速180 r/min。在最佳发酵培养基和培养条件下,菌株PY-1发酵液抑菌率达到99.26%,抑菌能力提高8.35%。     

具有除草活性的生防菌株GD-9发酵条件优化及菌剂制备

为了明确具有除草活性的生防菌株GD-9发酵过程中各因子的配比和最优条件,采用单因素试验对菌株最适碳源、氮源、载体、固态发酵基质进行了筛选,应用正交试验设计研究了碳源、氮源、初始含水量、接种量、初始pH、培养时间、培养温度7种因素对菌株活菌数的影响。试验结果表明菌株GD-9最佳固态发酵条件为:氮源NaNO_3 58.4 mg/g,碳源葡萄糖48.4 mg/g,培养基质最适初始含水量为258 mg/g,最适接种量为0.26 mL/g,初始pH 7.6,最佳培养时间147.8 h,最佳培养温度30.7℃,最适宜的载体为黏土,分散剂为聚乙烯醇,稳定剂为膨润土,润湿剂为糊精。通过发酵试验结果制备生防菌株GD-9的固体菌剂,该研究为菌剂的商品化生产奠定基础。     

解淀粉芽孢杆菌HF—01发酵条件优化

为探讨解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliqruefaciensHF-01菌株液体发酵条件,提高其活性次级代谢产物的产量,以茵体生物量和发酵液拮抗柑桔绿霉病菌PenicilliumdigitatumSacc．活性为指标,采用单因子试验和正交设计方法对菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行优化。结果表明,菌株HF-01最适发酵培养基为葡萄糖3．0％、酵母提取粉0．5％、氯化钠0_3％、硫酸镁0．1％;最佳发酵培养条件为初始pH值6．0～6．5、培养温度28℃、培养时间48h、250mL三角瓶装液量90mL、接种量体积分数6％、摇床转速130r·min-1。在最佳发酵培养基和培养条件下,菌株HF-01抑菌能力提高37．3％;25℃条件下,优化后所得发酵滤液处理柑橘果实4d后,发病率为31．7％,病斑直径为25．9mm,显著低于优化前所得发酵滤液的发病率56．7％和病斑直径48．1mm。     

地衣芽孢杆菌WIO发酵产生抗茵蛋白的研究

地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisW10是1株生防细菌,其能产生抗菌蛋白,对多种植物病原菌有较好的抑制效果。本试验研究了菌株W10产生抗菌蛋白的发酵条件,为工厂化生产工艺提供技术支持。试验结果表明,接种菌龄12h,2％接种量,发酵液pH7．0,发酵培养60h是菌株W10产生抗菌蛋白的适宜发酵条件。控制发酵温度有利于抗菌蛋白积累,第一段温度为30℃培养20h,第二段温度为28℃至发酵结束。最佳溶氧量为20％。2次补料发酵效果要高于分批发酵,补料为500mL含10g．L-1葡萄糖和5g·L-1蛋白胨的培养基;选用200mg·L-1聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚（GPE消泡剂,泡敌）为消泡剂。利用优化的控制条件发酵培养菌株W10,与优化前相比,对目标病菌的抑菌率增加了34．6％。     

解淀粉芽胞杆菌MH71摇瓶发酵培养基及发酵条件优化

从黑龙江省漠河多年永冻土层采集的冻土样品中分离的拮抗菌解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens MH71,对多种植物病原真菌和细菌具有较强的拮抗作用.本研究主要以无菌滤液对番茄灰霉病菌的抑菌活性为检测指标,采用单因素试验筛选菌株MH71的最佳产抗菌物质培养基及最佳碳源、氮源和无机盐,运用Minitab软件,通过Box-Benhnken试验及响应面分析相结合的方法对该菌株产抗菌物质的发酵培养基配方和摇瓶发酵条件进行了优化.结果表明,菌株MH71产抗菌物质最佳培养基组成为玉米粉36.6 g/L、牛肉膏3.2 g/L、NaC1 1.33 g/L、葡萄糖14 g/L、蛋白胨7 g/L、MgSO4 0.4 g/L、K2HPO4 0.8 g/L、GaGO3 8 g/L.最适发酵条件为培养温度30℃、摇床转速200 r/min、发酵起始pH 7.0、接种量3％、装液量100 mL/500 mL、发酵时间为72 h.在最佳培养基和培养条件下,菌株MH71的活菌数达到了2.1×109 CFU/mL,芽孢数为1.2×109 CFU/mL,同时对番茄灰霉病菌的抑菌能力较优化前提高了37.4％.     

生防链霉菌F-15摇瓶发酵条件的优化

采用单因素和正交试验设计,通过摇瓶培养对链霉菌菌株F-15产生抑菌活性物质的发酵条件进行优化。单因素试验结果表明,其最佳发酵条件为:玉米粉作碳源,KNO3作氮源,初始pH为7,培养时间为5 d,250 mL的摇瓶装液量为60 mL,接种量为150μL。优化后的培养基配比为:玉米粉3.0%、KNO33.0%、MgSO40.2%、NaCl 0.2%。     

地黄根圈土壤拮抗放线菌筛选、鉴定及发酵条件优化

为研究中药地黄根圈土壤拮抗性放线菌在植物病害生物防治中的应用潜力,用常规方法从地黄根圈土壤中分离获得42株放线菌。采用琼脂块法进行初筛,用纸片扩散法和生长速率法对抑菌效果最好的菌株DHR11进行抑菌活性复筛,通过形态、培养特征及16S rDNA序列分析研究其分类地位,并采用正交设计对从6种培养基中筛选的最佳培养基进行优化。结果表明:4株放线菌对供试植物病原真菌有较好的拮抗作用,其中菌株DHR11对苹果炭疽病菌Colletotrichum gloeospori-oides的抑菌活性最高,抑菌圈直径达30mm,抑菌率达52.5%;菌株DHR11发酵9天时抑菌活性最高;最优培养基组成为:蔗糖15 g、可溶性淀粉25 g、大豆粉10 g、酵母膏7.5 g、K2HPO40.5 g、自来水1000 mL;最佳发酵条件为:培养基初始pH7.5,接种量15%(v/v),摇床转数220 r/min,装瓶量80mL/250 mL,28℃发酵9天。根据形态、培养特征及16S rDNA序列分析,初步鉴定DHR11为加利利链霉菌Streptomyces galilaeus。     

根肿病生防放线菌B18发酵条件的研究

B18是一株对十字花科根肿病菌Plasmodiophora brassicae具有抑制作用的优良生防放线菌,其活菌以及发酵液都可抑制根肿病菌休眠孢子萌发。为提高其菌体量以及孢子萌发抑制率,本文以菌体生物量和发酵液抑制根肿病菌休眠孢子活性为指标,通过单因素试验和正交设计优化B18的发酵培养基组分以及培养条件。结果表明:B18最适发酵培养基(1L)为蔗糖20 g,大豆粉10 g,牛肉膏5 g,NaCl 2.5 g,CaCO3 2.0 g;且在初始pH 7.0,初始接种量3%~7%,装瓶量150 mL/250 mL,温度25~30℃,150~200 r/min下发酵 72 h 所得的发酵液对孢子萌发抑制率最高且菌体量最大。随后测定了发酵条件优化后的B18发酵液的热、酸碱、紫外线以及储藏稳定性。结果表明:B18发酵产物的热稳定性较差,40℃以上其抑菌活性随着温度的升高而降低;发酵液在酸性、中性以及弱碱性条件下稳定性较好,在强碱性条件下稳定性变差;发酵液对紫外线不敏感,有较好的稳定性;发酵液在4℃条件下更稳定,30 d时孢子萌发抑制率仍可达到61.58%,常温条件下不稳定,15 d后抑制率明显降低。     

生防菌枯草芽孢杆菌BS-5在3L发酵罐中的发酵工艺优化

为了提高生防菌枯草芽孢杆菌BS-5液体发酵的生物量,在3L发酵罐中进行了分批发酵和补料发酵试验。在分批发酵中,将氮源物质豆粕浓度由2％提高到4％之后,生物量由4.8×10^9cfu／ml提高到8.2×10^9cfu／ml。在分批补料发酵中,采取分批多次补糖策略。初糖浓度为20g／L,当糖浓度在10g／L以下时,补加葡萄糖（每次补加量为20g／L）,共补加两次,生物量提高到2.8×10^10cfu／ml。     

不同温度条件下农作物秸秆产气效率研究

采用自行设计的可控性恒温发酵装置,选取了小麦秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆3种单一原料为发酵原料,以5℃为一个步长,设定了7个恒定温度10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下的发酵方案;试验结果表明7个温度梯度下,3种原料均能正常发酵产生沼气,原料产气率随温度上升而上升;40℃下的产气效率最好(小麦秸秆的峰值为2 520.0 mL,干物质产气率为187.1 mL/g,水稻秸秆的峰值为2 100.0 mL,干物质产气率195.0 mL/g,玉米秸秆的峰值为2 395.0 mL,干物质产气率为228.5 mL/g),10℃下产气效率最差(小麦秸秆的峰值为377.5mL,干物质产气率为20.1 mL/g,水稻秸秆的峰值为305.0 mL,干物质产气率17.2 mL/g,为玉米秸秆的峰值为252.5 mL,干物质产气率为15.0 mL/g)。     

分批发酵和补料分批发酵生产木霉素的研究

为了提高木霉素的发酵产量,以哈茨木霉Trichoderma harzianum Rifai菌株LC2为生产菌,在10L发酵罐中对分批发酵和补料分批发酵工艺进行了研究。结果表明,在分批发酵工艺中,在8%接种量、4L/min通气量和200r/min搅拌转速条件下,发酵72h时木霉素产量达到最大值149.6mg/L。在间歇补料分批发酵工艺中,分6次补料,使培养基中各成分的终浓度与分批发酵相同,木霉素的发酵产量提高到182mg/L,比分批发酵提高21.7%。     

木霉Tr-92菌株厚垣孢子发酵条件的优化

利用单因素试验、正交试验方法对木霉Tr-92厚垣孢子发酵培养基及培养条件进行优化,筛选获得了适合此菌株厚垣孢子产生的最佳培养基组成为:草炭2.5%,玉米浆4.5%,葡萄糖2%,酵母膏0.5%;最佳培养条件为:接种量3%,装液量75mL/250mL,转速为180r/min,初始pH 5.0,温度28℃,培养时间7d。在此培养条件下,木霉Tr-92菌株厚垣孢子产量达到3.01×108个/mL。与优化前相比,厚垣孢子产量增长130.80%。通过培养条件优化确定了适合木霉Tr-92菌株产生厚垣孢子的条件,为高效木霉厚垣孢子生防菌剂的研制奠定了基础。     

甲基营养型芽胞杆菌BMF 04固态发酵条件优化及其对黄瓜幼苗生长的影响

甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus BMF 04是本实验室从连云港海域分离纯化得到的对多种植物病原真菌有较强抗菌作用的优良生防菌株.为进一步开发应用该菌株,以细菌总数和芽胞率为指标,通过单因素和响应面试验设计,优化固态发酵培养基配方和发酵条件,采用室内盆栽试验,测定发酵物对黄瓜幼苗生长...     

青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458发酵工艺的优化

为提高防治青枯病的植物疫苗菌FJAT-1458的发酵工艺,本文采用液固双相发酵方式,以活菌体数量为指标,通过单因子和正交设计试验对菌株FJAT-1458液体发酵培养基进行优化,并利用农业副产物——微生物发酵床养猪垫料为发酵培养基主成分进行固体培养工艺优化,为研制植物疫苗菌剂提供基础。结果表明,菌株FJAT-1458液体发酵的最适培养基配方为玉米粉2.5%、鱼骨粉0.5%、蔗糖0.1%、蛋白胨0.15%、K₂HPO₄ 0.05%和MgSO₄ 0.025%,发酵48 h后,发酵液活菌含量可达3.87×10⁹ cfu/mL。该菌固体发酵最佳培养基配方为垫料:黄豆饼粉=7:3（质量比）,最佳发酵条件为温度35℃、含水量45%、接菌量15%、通气量70%时,培养40 h后,固体菌剂活菌量达4.68×10⁸ cfu/g。     

生防菌株Men-myco-93-63发酵培养条件研究

对生防链霉菌Men-myco-93-63进行了摇瓶培养条件试验。结果表明,培养温度30℃,培养基初始pH值7.5,500ml三角瓶装液100ml,摇床转速200r/min为最适摇瓶发酵培养条件。在优化的培养条件基础上进行了摇瓶中代谢情况的测定,并在摇瓶试验的基础上进行了30L发酵罐试验,为进一步发酵规模化生产奠定了基础。     

不同发酵条件对瓜类细菌性果斑病菌感染西瓜种子的影响

西(甜)瓜果斑病是西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli侵染瓜类作物引起的典型细菌病害,种子带菌是该病最重要的传播方式,防止种子感染是病害预防的首要环节。本研究分析了西瓜种子不同发酵条件对种子感染病菌的影响。研究通过人工接种西瓜发酵液,设置发酵温度为20℃和30℃,检测在不同发酵时间下发酵液pH、A.citrulli菌量、种子外部带菌量、种子内部带菌率,以及出苗发病率,系统地分析比较发酵条件对西瓜嗜酸菌侵染种子的影响。结果表明:从开始发酵到发酵24h,发酵液中A.citrulli菌量快速增长并达到峰值1011cfu/mL,随后逐渐减少;发酵24h的种子外部带菌量最高,达到4×109 cfu/mL;发酵过程中A.citrulli可侵染种皮内部(10%)及种仁(1%);发酵温度对种子感染A.citrulli及幼苗发病率的影响不显著;此外,发酵液菌量与pH相关性显著。以上研究结果表明:控制发酵温度并不能够减少A.citrulli菌的种子感染,减少发酵时间才是减少病菌增殖感染种子的防控关键。     

苏云金杆菌发酵过程的代谢研究

测定了苏云金杆菌发酵过程中总核酸,菌数、总糖、还原糖、溶磷、氨基氮、pH和溶氧的变化。核酸曲线与苏云金杆菌典型生长曲线的形状相似,随培养基浓度而增减,因此认为发酵液的核酸含量可以反映菌体数量。在发酵罐发酵条件下,A、B配方培养基在发酵结束时的残糖分别为起始浓度的62.75％和66.6％,表明碳源的供给是充裕的,但溶氧和溶磷在对数生长期都降至很低水平,启示调整溶氧,增加溶磷可能与进一步提高发酵菌数密切相关。