猪细小病毒7型广西分离株全基因组序列分析

采集2017年中国广西壮族自治区部分地区猪组织样品,并对PPV7的流行情况进行调查分析。采集健康猪和患病猪样品的PPV7感染率分别为66.7%和84%。此外健康猪和患病猪PCV2共感染率分别为51.74%和77.33%。二者的高感染率表明PPV7可能与PCV2感染存在一定关系。随机选取3份PPV7阳性样品进行主要结构基因测序,并进行系统进化分析。结果显示,3份样品中全基因组序列同源性为94.1%～99.6%,NS1基因核苷酸序列同源性为96.0%～100%。cap基因核苷酸序列同源性为93.9%～97.6%。与PPV7参考株相比,NS1基因同源性为94.2%～97.6%,cap同源性为87.4%～95.0%。在3株PPV7全长基因组,其cap基因分别编码474,470及469个氨基酸,而作为参考的PPV7 42株则编码469个氨基酸,cap基因序列变异导致cap编码区域氨基酸序列的增加。     

猫细小病毒CC-1株NS1全基因的克隆及序列分析

根据GenBank中收录的猫细小病毒(FPV)CU-4株基因序列设计引物,扩增本实验室分离保存的FPV CC-1株NS1基因,并进行序列测定。结果表明,该毒株NS1基因序列长度约为2.35 kb,该基因的阅读框总长为2007 bp,编码668个氨基酸。该序列与FPV193/70株、PLI-IV株、TU-2株、CU-4株、94-1株和X J-1株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.0%、98.9%、98.8%、98.7%、98.6%、99.4%,氨基酸的同源性分别为98.8%、98.7%、98.5%、98.7%、98.5%、99.3%。该毒株与犬细小病毒(CPV)、貂细小病毒(MEM)、大鼠细小病毒(RPV)、猪细小病毒(PPV)、鹅细小病毒(GPV)、鼠细小病毒(MVM)NS1的进化树分析表明,它与MEM和CPV的亲缘关系比较近,与PPV的亲缘关系较远。     

猪伪狂犬病病毒ZY-2014株的分离与鉴定

从河南省某规模化猪场的死亡仔猪中分离到1株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为ZY-2014株,并对其进行了PCR鉴定、g E基因序列分析、动物感染试验等鉴定。病毒经vero细胞培养可产生典型细胞病变,用Reed-Muench法测定病毒的滴度为107.4TCID50/100μL。分离病毒基因组DNA经过g D、g E、g G、三对特异性检测引物扩增后,均出现伪狂犬病毒特异性目的条带,分别为217 bp、636 bp、1440 bp。测序结果与预期结果相符。将ZY-2014毒株g E基因测序结果与10个新分离毒株、14个经典毒株进行同源性比对分析,其核苷酸及推导的氨基酸序列与国内2012年以来新分离毒株的同源性分别为99.6%~100%和99.1%~100%,与2012年以前分离毒株核苷酸及推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%~99.6%和95.7%~99.3%。遗传进化树结果显示,所分离的ZY-2014毒株与2012年以来新分离毒株同属一分支,与经典毒株分属不同进化分支。动物攻毒试验中,家兔和小鼠均出现明显的伪狂犬病临床症状。鉴定试验表明,分离株ZY-2014是一株猪伪狂犬变异毒株。     

北京市猪场猪圆环病毒3型感染状况调查及其ORF2基因遗传进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在北京市不同区县猪场中的流行情况,研究建立PCR检测方法,对来自北京市8个区县56个养殖场的1177份临床样品进行检测,并对获得的部分ORF2全基因序列进行遗传进化分析。结果显示,PCV3总体阳性率为1.0%(12/1177),猪场阳性率为8.9%(5/56)。对PCV3阳性样本进行ORF2基因测序及同源性比对,共测得12株PCV3 ORF2全长基因序列,其中包括6株不同的ORF2全长基因序列。结果显示,该6株序列之间的核苷酸相似性为97.7%～99.5%,推导氨基酸序列的相似性为97.2%～100%;与参考毒株之间的核苷酸同源性为96.0%～99.5%,推导氨基酸同源性为92.1%～100.0%;进化树显示北京毒株属于PCV3b基因型。试验表明,PCV3在北京多个猪场呈现一定的流行趋势,流行毒株以PCV3b基因型为主。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断

为确诊广东省阳江市某规模化猪场(存栏800头母猪)保育猪发病死亡的原因,本试验对从该发病猪场采集的3份肺脏、肝脏、脾脏临床样品进行细菌学检测及药敏试验,采用PCR/RT-PCR检测临床样品中猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和猪肺炎支原体等病原。对特异性扩增的3株PRRSV的ORF5基因产物进行序列测定,与VR2332、HuN4、JXA1、CH-1a等代表毒株进行核苷酸序列同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,试验分离鉴定出1株副猪嗜血杆菌(Hps),对7种临床常用药如阿莫西林、头孢拉定等均有较强的敏感性。同源性比对结果表明,3株PRRSV(LJW1、LJW2和LJW3)ORF5基因核苷酸同源性为99.3%～99.8%,与欧洲型代表毒株Lelystad核苷酸同源性为64.0%～64.2%,与HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4、CH-1a和TJ核苷酸同源性较高,分别为99.2%～99.5%、99.0%～99.3%、94.5%～94.9%和98.8%～99.2%;与中国河南和广西分离的HP-PRRSV毒株HeNzm1-16和GXLZ05-2015核苷酸同源性较高,分别为99.3%～99.7%和99.2%～99.7%,与美洲型经典疫苗株MLV、美洲型标准株NC、美洲型经典株VR2332核苷酸同源性较低,分别为88.5%～88.8%、85.2%～85.5%和82.3%～82.6%。PRRSV ORF5基因系统进化树分析表明,3株PRRSV均属于美洲型毒株,与国内HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ等处于同一分支,亲缘关系较近。本研究揭示了该场保育猪发病病原,并从分子水平上明确了分离的3株PRRSV与不同代表毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRSV提供了参考依据。     

牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL分离株全基因序列测定与分析

为了解中国农业科学院特产研究所分子生物学重点实验室前期分离的牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL毒株完整的基因序列信息,本试验对BVDV-JL F6代毒株进行了完整基因序列测定。利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了BVDV-JL分离毒株的7段cDNA片段,分别克隆于pMD18-T载体并进行测序。BVDV-JL株基因组序列全长为12276 bp,编码3901个氨基酸。基因组两端为非编码区5'UTR和3'UTR。基因比对及进化树分析结果表明BVDV-JL与BVDV CP7同源性最高,核苷酸同源性为93.2%,归类于BVDV-1b2基因亚型。BVDV-JL是第1个在中国报道的BVDV-1b2亚型毒株。了解BVDV-JL完整基因序列有利于中国BVDV流行病学调查。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物，对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT—PCR扩增，并将其克隆到pMD18-T载体上，分别获得了全长为817、851、854、854bp的全基因序列。序列分析结果表明，新疆毒株间的核苷酸同源性为97．8％～98．9%，氨基酸同源性为96．5％～98．7％，与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较，同源性为90．0％～99．4％；与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较，同源性为81．4％～99．3％。系统进化树分析表明，新疆株独立分支。     

猪伪狂犬病病毒FZ-2012株的分离鉴定及其gE基因的遗传演化分析

从福建省某猪场采集疑似猪伪狂犬病的病料接种PK-15细胞,通过PCR法、动物试验证实所分离的病毒为猪伪狂犬病毒(PRV),命名为FZ-2012,经测定该病毒株TCID50为10-9.40/0.1mL。根据Gen Bank已公布的PRV gE基因序列设计了1对特异性引物,将PCR扩增片段进行克隆测序,与国内外已发表的2012年以来15个新分离毒株、11个经典毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:FZ-2012株gE基因序列全长1740 bp,编码579个氨基酸,与新分离毒株gE基因氨基酸序列的同源性为97.6%~99.3%,与经典毒株的氨基酸序列同源性为95.0%~98.6%;遗传进化关系表明,FZ-2012毒株与新分离毒株同属一分支,而与经典毒株分属2个不同分支。本研究首次报道福建省存在PRV新流行毒株,为丰富福建省猪伪狂犬病的分子流行病学和开发猪伪狂犬病新型疫苗奠定基础。     

广西猪细小病毒6型分子流行病学调查

为了解广西壮族自治区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株,分析其分子特征和遗传进化,本研究利用PCR技术对广西壮族自治区的猪血清临床样本进行检测。结果表明,广西壮族自治区猪群有PPV6的存在,感染率为18.5%(25/135),与PCV2的共感染率为24.0%(6/25)。与参考毒株的NS1核苷酸同源性为99.4%～99.6%;NS1遗传进化分析表明,GX44毒株和GX3-3毒株与中国参考毒株TJ株、韩国KSU1-AZ-2014株、波兰P15-1株同处一个亚群,而美国U18-9株属于另一个亚群。这一研究结果将为中国PPV6毒株的流行病学调查与分析提供最基础的研究资料。     

贵阳地区犬细小病毒NS1基因的克隆及序列分析

为了解贵阳地区犬细小病毒(CPV)非结构蛋白NS1的遗传变异进化状况,试验采用PCR检测、分子克隆、测序及生物信息学软件对分离自贵阳的8株CPV的NS1基因进行序列分析。结果表明:成功扩增并克隆测序得到8株CPV NS1基因,全长为2 007 bp,共编码668个氨基酸;分离株间NS1基因核苷酸序列的同源性为98.4%～99.8%,与10株犬类参考毒株CPV NS1基因序列的同源性为98.3%～99.6%,与其他11株非犬类参考毒株NS1基因核苷酸的同源性为39.4%～99.1%。说明CPV NS1基因具有一定的种属特异性,其亲缘关系越近同源性越高。