柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp 外膜重组蛋白、应用PCR 方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙 病菌omp 基因的3 个片段、将其克隆到pMDl9-T 载体、再亚克隆到pET32a 原核表达载体、构建pET32a-omp 原核表 达重组质粒、然后转化大肠杆菌BL21（DE3）、经IPTG 诱导并用SDS-PAGE 电泳检测带组氨酸标签的Omp 融合蛋白 表达后、用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明院柑桔黄龙病菌omp 基因序列的两个片段在37益经1 mmol/L IPTG 诱导后、在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小（约55 ku）的融合蛋白。     

牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一，具有细胞因子样功能，在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体，将M17基因插入pET-32a原核表达载体，构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，通过IPTG诱导M17蛋白表达，利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示，IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主；Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL^-1；多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16，经Western blotting分析可见单一目的条带，说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知，M17重组蛋白表达成功，且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。     

马铃薯M病毒衣壳蛋白原核表达和多克隆抗体制备

本研究利用RT-PCR技术从发病马铃薯植株叶片中克隆马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)的衣壳蛋白全长基因,该基因由912个碱基组成。将其亚克隆到表达载体pET-28b(+)中后,转化大肠杆菌菌株Rosetta。经IPTG诱导处理后,获得的重组蛋白大小约为33 kDa,与预期大小一致。经镍离子亲和层析纯化后免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体,免疫4次后多抗血清效价为1∶64 000。经ELISA和Western blot分析表明,多克隆抗体能够特异性的识别PVM。PVM多克隆抗体的制备为PVM快速检测方法的建立奠定了基础。     

弓形虫棒状体蛋白15的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆弓形虫（Toxoplasma gondii）RH虫株速殖子的棒状体蛋白15(ROP15)基因,原核表达、纯化重组蛋白,并制备多克隆抗体。【方法】根据GenBank登录的弓形虫RH株ROP15(DQ096561.1)基因序列设计了1对引物,以提取的弓形虫RH虫株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR获得该虫株的ROP15基因,将该基因连接至原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组质粒pGEX-4T-ROP15,测序结果与预期结果一致;转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,运用亲和层析法纯化可溶性ROP15重组蛋白,SDS-PAGE对表达和纯化的目的蛋白进行分析。用纯化的ROP15重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,运用Western blot分析特异性。【结果】成功克隆了弓形虫RH虫株速殖子ROP15基因,大小为924 bp;菌液PCR和酶切鉴定表明重组质粒pGEX-4T-ROP15构建成功,获得了约59 ku的可溶性融合蛋白表达产物;以纯化的可溶性ROP15重组表达蛋白为抗原制备兔源性抗血清,Western blot显示该多克隆抗体与ROP...     

马铃薯液泡蔗糖转化酶原核表达及多克隆抗血清的制备

马铃薯液泡蔗糖转化酶在马铃薯块茎低温糖化过程中起着关键作用。将马铃薯液泡蔗糖转化酶基因StVIN1的N端部分片段连接到原核表达载体pET-28a,将重组质粒pET-28a-StVIN1-N通过热激的方法转化到宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,经0.84 mmol/L IPTG诱导得到带有6×His标签的融合蛋白。以纯化后的蛋白为抗原免疫家兔,获得多克隆抗血清。利用得到的抗血清对纯化后的蛋白进行Western blot鉴定,结果表明所制备的多克隆抗血清具有良好的特异性。     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FM-DV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE分析;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105 kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5 120,[结论]为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒非结构蛋白C的原核表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒(PPRV)中扩增出C基因。将C基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建出重组表达质粒pGEX-6P-1-PPRV-C。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞后,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达出的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定正确后,免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果表明:C蛋白在大肠埃希菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为42ku;Western-blot结果表明重组C蛋白具有良好的反应原性;琼脂扩散试验结果表明制备的抗C蛋白多抗血清效价为1∶2。这一研究成功克隆出C基因,制备出多克隆抗体血清,为今后进一步深入研究C蛋白的功能提供了生物材料。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

淡紫拟青霉丝氨酸蛋白酶基因克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索利用大肠杆菌进行丝氨酸蛋白酶PL基因的克隆与表达及抗血清制备的方法。[方法]根据报道的PL蛋白基因序列设计1对引物,通过RT-PCR扩增获得PL基因片段,对重组载体进行构建、鉴定和序列分析,用表达的特异蛋白条带制备抗原,免疫家兔制备抗血清。[结果]通过RT-PCR扩增得到长约850 bp的PL基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,获得的重组子pET-22b-PL转化E.coliBL21(DE3),经最终浓度为1 mmol/L IPTG诱导37℃培养4 h,获得约31 kDa大小的重组蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该蛋白表达量占菌体总蛋白的60%,说明该蛋白得到了高效表达。用表达的特异蛋白条带制备的免疫家兔制备抗血清,经ELISA测定效价为1/10 000。[结论]通过基因重组可获得PL基因在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性。     

动物体蛋白合成与降解规律研究进展

动物的生长发育速度实质反映了体蛋白沉积量的变化。体蛋白沉积量主要受蛋白质合成和蛋白质分解两方面的共同影响 ,蛋白质合成除受到基因调控制约外 ,还受到饲料及营养因素诸如锌、铬、脂肪酸及生长激素水平等的影响。蛋白质的降解与日粮组成、采食量、饲喂次数及神经系统和胃肠产生的生产抑素有关。文章通过对体蛋白合成与降解规律及饲料营养成分对体蛋白的合成及降解影响的探索 ,提出了提高蛋白质饲料利用率 ,使动物生产实现最大化的应用前景     

HLA-G1的基因表达、纯化及其活性分析

在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。     

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

单细胞蛋白的开发及其在畜禽生产中的应用

介绍了生产单细胞蛋白的微生物种类,阐述了单细胞蛋白的安全性评价和营养性评价,以及单细胞蛋白在畜禽生产中的应用效果,针对单细胞蛋白的存在问题提出了相应的解决方法。     

Expression and Purification of Recombinant MP-GFP Protein in Escherichia coli

Guided pesticide is an unique compound resulted from the conjugation with carrier (amino acid, protein, sugars, etc) and the active pesticide ingredient. One of the attributes of the guided pesticide is its potential to accumulate at the site of the damaged points caused by pest or at the site of entry to the target pests, such as via inhalation, cuticular penetration, and oral digestion. Movement protein (MP) is a kind of protein coded by plant virus. A genetic fusion between green fluorescent protein (GFP) and movement protein resulted in the expression of a fluorescent fusion MP-GFP protein, which was fully biologically active in mediating the cell-to-cell spread of virus. In order to obtain a suitable carrier for a pesticide,fluorescent carrier MP-GFP was constructed. It was found that the recombinant MP-GFP protein was the inclusion body.The results indicated that optimized cultural condition for expression of recombinant MP-GFP protein was incubation at 37℃ for 2 h and induction with 0.2 mmol L-1 IPTG (isopropyl-β-dthiogalactopyranoside) at 25℃ for 4 h. MP-GFP protein was purified by using Ni-NTA resin. The expressed recombinant MP-GFP protein had both the fluorescence character of report GFP gene and moving character of movement protein. It could provide a guided carrier for studying the guided pesticide. It could also provide convenience for studying the delivery and distribution of the guided pesticide ingredients in the plant.     

饲料真蛋白质含量与饲料品质检验方法的探讨

以16种饲料原料为研究对象,测定其粗蛋白质与真蛋白质含量。结果表明,16种饲料原料中,真蛋白质占粗蛋白质的比例变幅为45.42%-90.74%。酒精粉、鱼粉、微生态制剂（猪）、微生态制剂（蛋鸡）、华润酒精蛋白、沈阳酒精DDG、DDGS、沈阳玉米脐粕的真蛋白质占粗蛋白质的比例超过了80%,其余种类饲料原料的真蛋白质含量远低于粗蛋白质含量,豌豆粉和精蛋白的真蛋白质占粗蛋白质的比例只有45.42%和47.97%。说明从蛋白质质量角度讲,部分饲料真蛋白质含量较低,可能是影响饲料品质的一个重要因素。     

菜粉蝶气味结合蛋白和化学感受蛋白生物信息学分析

气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在菜粉蝶(Pieris rapae)气味识别的过程中发挥着重要作用。通过本地BLAST等方法在菜粉蝶基因组中找到了推测的OBPs和CSPs蛋白序列,采用多序列比对、半胱氨酸模式序列识别、进化发育树构建等方法,鉴定出了24个PrOBPs和38个PrCSPs基因。其中,PrOBP1-PrOBP17这17个OBPs属于Classic OBPs蛋白家族,PrOBP19-PrOBP24属于Minus-C OBPs蛋白家族。鉴定出的38个PrCSPs都具有鳞翅目CSPs的半胱氨酸模式识别序列。本实验通过对菜粉蝶基因组中OBPs和CSPs基因的查找鉴定,丰富了昆虫OBPs和CSPs基因数据库,可为菜粉蝶气味识别和化学感受相关实验和应用提供参考。     

狂犬病病毒G蛋白的原核表达及反应原性分析

为优化狂犬病病毒G蛋白的原核表达条件,探究其反应原性,参照狂犬病病毒CTN-1V10株编码G蛋白基因序列,采用生物工程合成的方法合成编码G蛋白的基因片段,并将该片段命名为G5F。将该片段与pET-28a原核表达载体连接,构建重组表达质粒pET-G5F,并将重组质粒进行诱导表达,在IPTG浓度为0.2 mmol/L、温度为20℃、诱导12 h时,重组蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳及Western blot分析表明,G5F重组蛋白可溶性表达量高,且可以被抗狂犬病病毒单克隆抗体识别,反应原性良好。     

SARS病毒S蛋白S1和S2片段的合成及在大肠杆菌中的表达

[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。