仔猪产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻仍然是困扰世界养猪业的重要疾病之一，产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起仔猪腹泻的重要病原菌。在饲料中添加抗生素、喂服特异性抗体、膳食调节、利用遗传育种选育等多种方法被用来预防和治疗ETEC引起的感染。相比其他预防措施，疫苗接种是防制ETEC引起仔猪腹泻的最经济和最有效的手段。就目前猪用ETEC疫苗的最新研究进展进行综述，并分析了ETEC疫苗研究中面临的挑战，提出了高效疫苗的研究策略，旨在为ETEC新型、安全、高效和广谱疫苗的研发提供依据。     

产肠毒素大肠杆菌k88ac基因原核融合表达载体的构建

利用PCR技术扩增出菌毛K88ac基因片段,并将其插入到原核表达载体pET32a( )的多克隆位点上。测序结果表明:与Genbank中序列比对同源性达到99%以上,成功构建了原核表达载体。为进一步的研究工作,奠定了基础。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

对已构建的重组质粒ｐＸＳＴ１进行了核苷酸序列分析和免疫原性研究。序列分析结果表明，该粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫实验结果表明，构建的ＤＨ５α重组菌株安全无毒。     

抗大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]培养大肠杆菌耐热性肠毒素ST1单克隆抗体的细胞株,建立一种快速、灵敏、特异和便于临床操作的检测耐热性肠毒素ST1的方法。[方法]将制备的ST1包涵体与弗氏完全佐剂充分混匀,免疫BALB／c小鼠,取其脾脏细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞进行融合,然后用间接ELISA法筛选和有限稀释法进行细胞克隆。[结果]获得2株能稳定分泌抗ST1肠毒素单抗杂交瘤细胞株。[结论]将单克隆抗体与酶联免疫吸附实验两者相结合可有效获得所需的杂交瘤细胞株,为下一步临床检测奠定了基础。     

乳酸杆菌S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞的协同作用

设计3种黏附试验分别研究了嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞的影响。结果显示:在置换试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞没有影响;但在排斥试验和竞争试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白均对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞产生明显的协同作用,在排斥试验中嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白分别增加产肠毒素大肠杆菌的黏附数量95.23%±4.22%(P0.01)和352.30%±2.26%(P0.01),在竞争试验中分别增加389.06%±3.35%(P0.01)和55.57%±5.81%(P0.05);并且S-层蛋白在排斥试验中,对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用大于竞争试验中的协同黏附作用。可见,乳酸杆菌对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用关键在于S-层蛋白,S-层蛋白可能起到"连接桥"的作用。     

大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅰ和卵清蛋白融合蛋白的表达及免疫原性分析

为探究大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅰ(Heat-stable toxin typeⅠ,STa)和鸡卵清蛋白(Chicken ovalbumin)串联表达的3×STa-ovalbumin重组融合蛋白的免疫原性,原核表达融合蛋白后,经SDS-PAGE和Western blot方法鉴定,将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,利用ELISA方法测定免疫小鼠血清中抗STa抗体的滴度,应用体外中和试验检测抗体对STa毒素的中和作用。SDSPAGE检测结果显示,融合蛋白分子质量约42 ku;Western blot分析结果显示,融合蛋白可被STa阳性血清特异性识别。小鼠免疫试验结果表明,融合蛋白具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗STa抗体滴度达到2.33,并且产生的抗体能在体外中和STa的毒性作用。以上结果表明,3×STaovalbumin融合蛋白具有良好的免疫原性。     

禽大肠杆菌O2、O78及其耐药、融合菌株的外膜蛋白免疫研究

为了研究大肠杆菌O2、O78及其耐药、融合菌株外膜蛋白的免疫原性,用Sarkosyl处理和超速离心技术相结合的方法分别提取禽大肠杆菌强毒株O2、O78,耐药弱毒株O2(Nor^rChl^s)、O78(Not^sChl^r)及其融合双价弱毒株O2.78(Nor^rCll^r)等5个菌株的外膜蛋白(OMPs),经SDS-PAGE,结果均出现1条相同的相对分子质量在31000-43000之间的主要OMPs条带,表明5个菌株存在相同的OMPs成分,将3个耐药菌株的OMPs分别免疫小白鼠和鸡,结果均产生对O2、O78良好的同源及交叉免疫保护效果,用各耐药菌株的OMPs做包被抗原,ELISA方法都能交叉检测3个耐药菌株OMPs免疫鸡血清中IgG水平,且各IgG的消长曲线基本一致。     

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术，构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测，证明外源基因已经整合到受体植物基因组中，同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得，为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。     

耐热型产肠毒素大肠杆菌检测方法的建立及应用

为建立检测产肠毒素大肠杆菌（ETEC）耐热型肠毒素STa和STb的纳米金PCR方法,根据ETEC耐热型肠毒素STa和STb的基因序列,用Primer 5.0软件设计了2对特异性引物,优化得到最佳反应条件,并进行灵敏度和特异性的测试.实验结果表明：本文所建立的体系均能扩增到目的条带,灵敏度为47.5 cfu/mL,且特异性良好;所建立的纳米金PCR方法在人工染菌实验中也获得了较高的灵敏度和特异性.     

产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的克隆与表达

应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的F5菌毛抗原基因片段,克隆测序后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,重组蛋白在BL21中得到表达并与F5菌毛单因子血清发生明显反应。     

猪产肠毒素大肠杆菌987P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌（ETEC）987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体（IgY）的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24 h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍（214）,但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

仔猪产肠毒素性大肠杆菌的血清学鉴定

从吉林省某些猪场采集发生典型典白痢的仔猪粪便样品５５份，采用ＥＭＢ选择培养基进行分离培养，得到４３株大肠杆菌，用Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ３种因子血清分别进行玻片凝集试验。结果阳性菌株有２３株，其中４株为Ｋ９９，占６０．９％；５株为９８７Ｐ，占２１．７％；３株含双粘附素（Ｋ９９、９８７Ｐ），占１３．０％；只有１株为Ｋ８８，占４．３％。     

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学诊断方法的建立

[目的与方法]在优化表达牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白和建立ELISA反应条件的基础上,进-步探讨牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白及其所建立的ELISA检测方法的特异性,从而建立牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法.[结果]牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA检测方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]所建立的GST-MSA-2c融合蛋白间接ELISA血清学检测方法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白抗原建立的牛巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

一株牛源产不耐热肠毒素大肠杆菌的分离鉴定

从遵义犊牛腹泻粪便中分离到一株大肠杆菌ZB9，通过微生物生理生化、Southern分析、PCR检测、免疫学及生物学毒性检测，鉴定为产LT的大肠杆菌，分析表明，该株菌与猪源、人源等产LT的大肠杆菌具有一定相似性。     

布鲁氏菌病不同血清学检测方法的比较

为比较不同布鲁氏菌血清学检测方法的性能差异,本研究采用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）、布鲁氏菌抗体快速检测试剂卡（GICA）4种常规血清学检测方法,分别对感染情况已知的87份羊血清（阳性53份,阴性34份）进行血清学检测,进而比较4种方法的敏感性、特异性与一致性。检测结果显示,BT的敏感性、特异性较为一般;GICA的敏感性较好,特异性一般;SAT与cELISA的敏感性、特异性较为良好。RBT与GICA的酸性检验结果（Kappa值）均小于0.81,与真实结果一致程度为高;而SAT与cELISA的Kappa值均大于0.81,与真实结果一致程度为极高。在临床诊断中推荐选用RBT与GICA作为初筛检测方法,对初筛检测结果为阳性的样本,结合临床症状,采用SAT与cELISA进行复核。     

内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的调查研究

为了阐明内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的流行情况,该研究以内蒙古自治区乌兰察布和鄂尔多斯地区部分牛场腹泻病例为研究对象,采集患病犊牛样本,采用PCR方法检测产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）的ST和LT基因进行ETEC菌株鉴定。研究结果显示,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率为11.71%,鄂尔多斯地区ETEC总阳性率为9.44%,其中0～2月龄阳性率为21.49%, 2～6月龄阳性率为5%, 6～18月龄阳性率为0。由此可知,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率高于鄂尔多斯地区,两个地区ETEC的流行情况和感染情况均以0～2月龄犊牛为主,为进一步开展犊牛腹泻疾病的防控提供了依据。     

产肠毒素大肠杆菌K88ac-STⅡ-LTA2/LTB融合基因在苜蓿中的表达

为提高农杆菌介导的苜蓿遗传转化效率,获得转K88ac-STⅡ-LTA2/LTB基因苜蓿植株,以苜蓿下胚轴为外植体,对影响遗传转化的预培养时间、农杆菌菌液浓度、筛选方式等进行研究.结果表明,苜蓿下胚轴预培养3 d,菌液浓度为OD6000.5,筛选剂Kan浓度第一阶段和第二阶段分别为30和50 mg/L ,延迟筛选7 d时转化效率最高.对转基因苜蓿进行PCR和PT-PCR检测,初步证实目的基因已经整合到苜蓿基因组中,转化率达28.4%.     

Luman-端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。