番茄细菌性叶斑病菌RPA检测技术研究

青枯菌为应对逆境胁迫,可进入活的但非可培养状态(viable but non-eulturable,VBNC).本文利用叠氮溴化丙锭(PMA)与PCR技术相结合,建立了一种快速有效区分青枯菌死活细胞的分子检测方法.基于hrcS基因序列,设计了一对青枯菌种特异性检测引物hrcSf/hrcSr;利用PMA对青枯菌Po82菌株的细胞悬浮液样品进行预处理,随后进行常规PCR扩增.结果表明,当样品中PMA质量浓度为3 μg/mL、曝光时间大于5 min时,PMA可有效抑制死亡菌体细胞中的DNA扩增;且对可培养和VBNC状态细胞中的DNA扩增没有影响;本试验建立的PMA-PCR方法能有效对包括VBNC状态在内的青枯菌活菌进行检测,避免了假阳性与假阴性结果的产生.     

PMA-qPCR检测十字花科黑斑病菌活菌方法的建立

利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光PCR技术相结合(PMA-qPCR),对PMA质量浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行优化,建立了检测十字花科黑斑病菌活菌的方法.结果显示,当PMA质量浓度为10μg/mL,避光条件下孵育5min、然后曝光10min,此条件下能够抑制107CFU/...     

马铃薯青枯病病菌PMA-PCR活菌检测体系优化与初步应用

应用叠氮溴化丙锭(PMA)与PCR技术相结合,建立一种有效快速检测包括活的非可培养状态(Viable But Non-Culturable,VBNC)在内的马铃薯青枯菌活菌的方法。根据青枯菌lpxC基因序列设计特异性引物lpxC5a/6a,探究不同PMA浓度、曝光时间对浓度为1×10~9 cfu/m L的热致死菌悬液中死亡菌体抑制效果的影响,确定PMA最佳处理方案,对采自云南地区的19份田间土样中的包括VBNC状态在内的青枯菌活菌进行检测。结果显示,引物lpx C5a/6a可特异性扩增青枯菌而产生304 bp的条带。当样品中PMA终浓度为40μmol/L,650 W卤素灯曝光15 min,PMA可有效抑制死亡菌体的扩增,而对包括VBNC状态在内的青枯菌活菌的扩增没有影响。在19份田间土样检测中,有7份土样检测出存在青枯活菌。     

PMA-PCR方法快速检测VBNC状态青枯菌

青枯菌为应对逆境胁迫,可进入活的但非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC)。本文利用叠氮溴化丙锭(PMA)与PCR技术相结合,建立了一种快速有效区分青枯菌死活细胞的分子检测方法。基于hrcS基因序列,设计了一对青枯菌种特异性检测引物hrcSf/hrcSr;利用PMA对青枯菌Po82菌株的细胞悬浮液样品进行预处理,随后进行常规PCR扩增。结果表明,当样品中PMA质量浓度为3μg/mL、曝光时间大于5min时,PMA可有效抑制死亡菌体细胞中的DNA扩增;且对可培养和VBNC状态细胞中的DNA扩增没有影响;本试验建立的PMA-PCR方法能有效对包括VBNC状态在内的青枯菌活菌进行检测,避免了假阳性与假阴性结果的产生。     

利用EMAqPCR建立快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法

利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-qPCR),建立了一种有效快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法。以猕猴桃溃疡病菌ITS序列为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行qPCR特异性扩增。结果显示,qPCR检测灵敏度为2cfu;当EMA的浓度为2.0μg/mL时,能有效抑制1.0×10~7 cfu/mL经高温灭活的死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×10~1~1.0×10~5 cfu范围内,每个qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R~2=0.988)。不同温度处理活菌菌悬液后用EMA-qPCR检测猕猴桃溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,结果表明待检样品可在4℃和20℃短期保存。对疑似带病猕猴桃材料进行EMA-qPCR检测,结果表明能减少猕猴桃溃疡病菌PCR的假阳性结果。本研究建立的EMAqPCR方法是一种有效检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。     

无菌水常温保存番茄青枯菌的效果检测

不同 pH的灭菌水常温保存不同浓度的番茄青枯菌 ,6年后检测其存活情况。结果表明 ,灭菌水常温保存番茄青枯菌效果与初始菌浓度和无菌水 pH有关。试验表明此种方法保存番茄青枯菌是一种保存时间长 ,保存性状稳定的方法。     

肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应研究

采用PRiME HLB固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱仪,建立了斑马鱼中肟菌酯残留的检测方法,并在此基础上研究了肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应。结果表明:在0.0001~0.05 mg/L范围内,肟菌酯进样质量浓度与峰面积之间具有良好的线性关系;当添加水平分别为0.0005和0.05 mg/L时,肟菌酯在水样中的平均回收率为86.6%~106%,相对标准偏差 (RSD)为5.1%~8.9%;添加水平分别为0.01、0.1和10 mg/kg时,其在鱼肉中的平均回收率为70.5%~104%,RSD为1.4%~3.3%。肟菌酯在水样中的定量限 (LOQ)为0.0005 mg/L,在鱼肉中的LOQ为0.01 mg/kg。利用所建立的方法,研究了在水生生物鱼类的1/10急性毒性基准剂量 (ALB) 值 (7.15 × 10?4 mg/L) 和ALB 值 (7.15 × 10?3 mg/L)、斑马鱼的1/100 LC₅₀值 ( 5.10 × 10?4 和1.20 × 10?3 mg/L)以及1/10 LC₅₀值 (5.10 × 10?3和1.20 × 10?2 mg/L)剂量暴露下,肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应。结果表明:经不同浓度肟菌酯连续暴露192 h后,肟菌酯在斑马鱼中的生物富集系数 (BCF)为113~178,具有中等生物富集效应。研究表明,生产中在使用肟菌酯时,应考虑其低浓度暴露下因生物富集作用而对水生生物引起的生态毒理学风险。     

无致病力青枯菌FJAT-a RS01的固态发酵及对茄果类蔬菜青枯病的防治效果

利用无致病力青枯菌研发植物疫苗防治青枯病是植物病害防治研究中的新途径。无致病力青枯菌FJAT-aRS01具有防效高和稳定遗传等特性。为了进一步开发利用该菌株,本研究以巨菌草渣为其主要发酵培养基,通过正交试验优化培养基配方和发酵条件,固态发酵FJAT-a RS01,并进行质量检测。结果表明,优化后菌株FJAT-aRS01固态发酵培养基配方为巨菌草渣36.36%、玉米粉27.27%、米糠27.27%和稻壳9.09%;发酵条件为接种量15%(10⁸ CFU/mL),料水质量比为1:0.8,装袋量为150 g/袋,发酵时间为48 h;在该发酵条件下,FJAT-aRS01的固态发酵物活菌数可达到1.80×10⁹ CFU/g,其营养成分含量超过微生物肥料的国家标准(NY/T 798-2015);FJAT-a RS01固态发酵物浸提液的50倍稀释液能促进番茄种子萌发,其100倍稀释液能促进辣椒和茄子种子萌发;在栽培基质中添加质量百分比≤15%的FJAT-aRS01固态发酵物能促进植株生长,添加质量百分比25%的FJAT-a RS01固态发酵物对于番茄、辣椒...     

柑橘溃疡病菌EMA-PCR快速活体检测技术的建立

传统PCR方法不能诊断柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri Gabriel)的死活状态,往往导致假阳性检测结果.本研究将特异性核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术结合,旨在建立柑橘溃疡病活菌的快速检测技术.根据柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计特异性引物扩增出278 bp的靶带,PCR反应的检测下限为25个细胞/25 μL或2.75 pg/25 μL.EMA-PCR结果表明:当卤钨灯曝光时间1 min,EMA终浓度为1.0 mg/L时,能有效抑制1.0×108 cfu/mL死菌的扩增;当EMA的浓度小于30 mg/L时,EMA对上述相同浓度活菌靶基因的扩增没有明显的抑制.EMA-PCR对死活混合菌的扩增表明,活菌数在6.875×101～6.875×105 cfu/PCR范围时,荧光强度与混合体系中活菌的对数值有线性关系.基于以上建立的EMA-PCR活体检测技术,对疑似带病柑橘材料进行检测,结果发现能降低柑橘溃疡病菌检测过程中的假阳性,有望为柑橘溃疡病的检疫检验提供更科学的技术手段.     

超高效液相色谱-串联质谱法快速检测核桃中戊唑醇､肟菌酯及肟菌酸残留

建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)同时测定戊唑醇?肟菌酯及其代谢物肟菌酸在核桃中的残留检测方法?样品中待测农药组分采用2%乙酸乙腈溶剂振荡提取, 弗罗里硅土(florisil)净化, 利用乙腈和0.2%甲酸水作为流动相梯度洗脱, C18色谱柱分离, 在多反应监测模式下定量分析, 基质外标法定量?结果表明:戊唑醇添加水平为5~500 μg/kg时, 戊唑醇在核桃中添加回收率为80.3%~100.8%, 相对标准偏差(RSD)为2.5%~11.7%; 肟菌酯和肟菌酸添加水平为2~200 μg/kg时, 肟菌酯在核桃中添加回收率为91.1%~102.9%, 相对标准偏差(RSD)为1.7%~12.5%; 肟菌酸在核桃中添加回收率为91.7%~101.9%, 相对标准偏差(RSD)为3.7%~9.2%?戊唑醇?肟菌酯和肟菌酸溶剂标准曲线和基质标准曲线在1~1 000 μg/L范围内线性关系良好, 相关系数均大于0.99?戊唑醇定量限为5 μg/kg, 肟菌酯和肟菌酸定量限均为2 μg/kg?实际样品检测中, 戊唑醇残留结果为6~99 μg/kg, 肟菌酯残留结果为<2~103 μg/kg, 肟菌酸均小于检测限?该方法操作简便?快捷和准确, 满足在核桃实际样品中戊唑醇?肟菌酯及其代谢物肟菌酸的残留检测要求?     

壳聚糖对青枯劳尔氏菌生长及其生物膜形成的影响

为建立快速检测壳聚糖抑菌效果的方法,研究其对青枯菌生物膜形成的影响并探索其抑菌机理,利用酶标仪检测壳聚糖与菌悬液混合培养物的吸光值,计算抑菌率,同时利用结晶紫染色法对壳聚糖处理后青枯菌生物膜形成能力进行评价,并进行透射电镜观察.结果表明,在壳聚糖浓度低于0.15 mg/mL时,随浓度增加其抑菌效果亦显著增加,其浓度超过0.15 mg/mL之后,其抑菌效果达到同一水平,最高抑菌率为74.3％;而壳聚糖浓度对青枯菌生物膜形成能力未产生显著影响;透射电镜观察结果显示:壳聚糖通过破坏青枯菌细胞膜抑制细菌生长.     

Survival of Ralstonia solanacearum Biovar 2, the Causative Agent of Potato Brown Rot, in Field and Microcosm Soils in Temperate Climates

ABSTRACT After outbreaks of potato brown rot in three different fields in the Netherlands, the fate of the brown rot pathogen, Ralstonia solanacearum biovar 2, was monitored in soil by immunofluorescence colony staining (IFC) supported by R. solanacearum division-2 specific polymerase chain reaction. In selected areas of all fields, the R. solanacearum population densities were initially on the order 10(4) to 10(6) per g of topsoil. These population densities then declined progressively over time. In two fields, however, the pathogen persisted for periods of 10 to 12 months. The survival of a selected R. solanacearum biovar 2 isolate, strain 1609, in three soils, a loamy sand and two different silt loam soils, was further studied in soil microcosm experiments. The effects of temperature and soil moisture content were assessed. At 12 or 15 and 20 degrees C, a gradual decline of the population densities was observed in all three soils, from the established 10(5) to 10(6) CFU g(-1) of dry soil to significantly reduced levels, occasionally bordering the limit of detection (10(2) CFU g(-1)of dry soil), in periods of approximately 90 to 210 days. Soil type affected the rate of population decline at 20 degrees C, with the greatest decline occurring in loamy sand soil. In all three soils, the survival of IFC-detectable R. solanacearum 1609 cells at 4 degrees C was severely impaired, reflected in an accelerated decline of CFU counts, to undetectable numbers. Moreover, indications were found for the occurrence of viable but nonculturable strain 1609 cells in the loamy sand as well as in one silt loam soil under these conditions. In addition, a single freezing-thawing cycle caused a significant additional reduction of the culturable R. solanacearum 1609 populations in the three soils, though detectable populations remained. Moderate soil moisture fluctuations of approximately pF 2 did not affect the survival of R. solanacearum 1609 in soil. Severe drought, however, drastically reduced the populations of strain 1609 CFU in all three soils.     

金龟子绿僵菌FM-03生物学特性及其对柑橘粉蚧的侵染

为明确金龟子绿僵菌FM-03菌株生物学特性及其对柑橘粉蚧的侵染效果,室内测定不同温度、pH、光周期、碳氮源对该菌株生长和产孢量的影响;观察柑橘粉蚧受该菌株侵染后的死亡趋势,构建该菌株对柑橘粉蚧的时间-剂量-死亡率（TDM）模型。结果表明,金龟子绿僵菌FM-03菌株培养最适的温度为25℃、pH 7、光周期12L：12D、碳源为乳糖、氮源为酵母膏,在此培养条件下菌落直径和产孢量分别可达6.17 cm和3.70×10⁹孢子/皿。柑橘粉蚧受菌株FM-03侵染后的死亡趋势随菌株浓度升高和侵染时间延长而上升,1×10⁸、1×10⁷和1×10⁶孢子/mL处理的升幅明显高于其他2个处理,其中在1×10⁸孢子/mL处理的累计校正死亡率最高可达82.02%;构建的TDM模型,通过Pearson卡方和Hosmer-Lemeshow检验,显示菌株FM-03对柑橘粉蚧的剂量效应随侵染时间的延长逐渐增强,时间效应随浓度的升高逐渐增强,侵染8 d后的LC₅₀和1.00×10⁸孢子/mL处理的LT₅₀分别可达6.03×10⁵孢子/mL和4.53 d。综上,金龟子绿僵菌FM-03菌株生长快、产孢量高,对柑橘粉蚧的致病力强,生防应用前景良好。     

Detection of Ralstonia solanacearum by loop-mediated isothermal amplification

Ralstonia solanacearum is a pathogenic bacterium that causes wilt in over 200 plant species. Here we report a rapid and sensitive detection of R. solanacearum using an isothermal method for copying DNA known as loop-mediated amplification (LAMP). A set of four primers was designed to replicate the gene coding for the flagellar subunit, fliC, and conditions for detection were optimized to complete in 60 min at 65 degrees C. Magnesium pyrophosphate resulting from the amplification reaction could be detected optically as an increase in the solution turbidity, and the DNA products spread in a reproducible ladder-like banding pattern after electrophoresis in an agarose gel. Replication of the fliC gene was detected only from R. solanacearum. The detection limit of this LAMP assay was between 10(4) to 10(6) colony forming units/ml, and the technique may be useful for developing rapid and sensitive detection methods for the R. solanacearum pathogen in soil and water.     

枯草芽胞杆菌YN2014090悬浮剂的研制

为研发出一种对番茄白粉病有稳定防效的微生物农药,以枯草芽胞杆菌YN2014090为有效成分,通过加入分散剂、润湿剂、增稠剂、紫外保护剂、防腐剂等助剂,按照相应比例混合,制得YN2014090悬浮剂,活菌数达到3.2×10^10 cfu/mL。结果表明,其配方为YN2014090菌粉15%、黄原胶2.2%、分散剂EMA 8%、600#12%、D425 2.2%、OP-10 2.2%、吐温20 1.2%、PEG600 1.2%,尿素0.3%,对羟基苯甲酸甲酯0.12%。所制悬浮剂p H在8.20~8.30,细度(<10μm)通过率大于95%,持久泡沫量(1min后)小于38 mL,倾倒后残余物质量分数小于5%,洗涤后残余物质量分数小于0.4%。连续两次药后11 d对番茄白粉病的防效达到94.21%,表明新研制的悬浮剂对番茄白粉病有较好的防治效果。     

金龟子绿僵菌对石蒜绵粉蚧的室内毒力与防治效果

石蒜绵粉蚧是近年我国新记录的一种有害生物,目前在福建省漳州地区的多肉植物种植基地发生为害严重。为探讨金龟子绿僵菌F061和FM-03对该虫的生防潜力和应用前景,本研究测定这2株菌株对石蒜绵粉蚧的室内毒力和防治效果。结果表明,石蒜绵粉蚧受菌株F061和FM-03侵染10 d后1×10⁸孢子/mL处理浓度的累计校正死亡率分别为83.15%和91.95%;构建的2个TDM模型均通过Pearson卡方和Hosmer-Lemeshow检验,2株菌株对石蒜绵粉蚧的时间-剂量互作效应明显,剂量效应随侵染时间的延长逐渐升高,时间效应随菌液浓度的升高逐渐增强,菌株F061侵染10 d后的LC₅₀和1.00×10⁸孢子/mL处理的LT₅₀分别为5.55×10⁵孢子/mL和5.04 d,而菌株FM-03在同等条件下的LC₅₀和LT₅₀分别为1.11×10⁵孢子/mL和4.67 d,毒力强于菌株F061;此外,2株菌株1.00×10⁸孢子/mL处理浓度对石蒜绵粉蚧的室内防治效果也随试验时间的延长而提高,菌剂F061和FM-03喷施10 d后的室内防治效果分别为74.06%和81.32%。综上,2株菌株均可用于防控多肉植物上的石蒜绵粉蚧,菌株FM-03可优先开发应用,菌株F061可作为备选菌株使用。     

利用马铃薯全粉加工废水培养解淀粉芽胞杆菌产抗菌脂肽条件优化

为实现马铃薯全粉加工废水资源高值化利用,以马铃薯全粉加工废水为基础培养基,采用Plackett-Burman设计和Box-Behnken响应面设计,对解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens PC2利用马铃薯全粉加工废水发酵产抗菌脂肽的培养基进行优化。结果表明,马铃薯全粉加工废水蛋白质、游离氨基酸、游离淀粉和还原糖含量分别为16.0、2.11、0.18和1.29 mg/mL,钾、钙和镁含量分别为1.07、0.05和0.10 mg/mL,铁、锌、锰和铜含量分别为7.10、2.34、0.25和0.09 μg/mL。蔗糖、谷氨酸钠和硫酸铵是影响菌株PC2发酵抗菌脂肽的3个主要因素。菌株PC2以马铃薯全粉废水为基础培养基无抗菌脂肽产生,采用响应面法优化获得了产抗菌脂肽的最佳培养基配方为：蔗糖30.2 g,谷氨酸钠3.96 g,硫酸铵6.0 g,马铃薯全粉加工废水1000 mL,所得抗菌脂肽粗提物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为21.74 mm。采用单因素试验结合响应面法,获得最适发酵条件为：接种量6.0%,装液量50 mL/250 mL,初始pH 6.8,发酵温度31℃,摇床转速170 r/min,发酵时间35 h。获得的抗菌脂肽粗提物抑菌圈直径可达22.81 mm,较优化前增加了1.08 mm,发酵液活菌数由优化前的2.6×10⁸ CFU/mL提高至3.2×10¹⁰ CFU/mL。试验结果为马铃薯全粉加工废水资源化利用奠定了基础。     

玫烟色棒束孢FZ-01鉴定及对烟粉虱的防治潜力评估

为了明确从罹病烟粉虱Bemisia tabaci上分离的虫生真菌（菌株FZ-01）的分类归属及其生物防治的潜力,采用形态学特征观察和rDNA-ITS序列分析方法对该菌株进行鉴定,并对其生物防治潜力进行评估。结果发现：菌株FZ-01为玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea;该菌株在马铃薯PDA培养基上生长良好;适应温度和酸碱度范围较广,可耐高温（35℃）和酸碱（pH4～10）;孢子萌发速率快（5 h）且萌发率高（>90%）;菌株致病力测定表明分生孢子浓度为1.0×10⁷ cfu/mL时,对烟粉虱（MEAM1）成虫致死中时间（LT₅₀）仅为2.75 d,接菌4 d时致死中浓度（LC₅₀）仅为2.69×10⁴ cfu/mL。综上结果表明,玫烟色棒束孢FZ-01对烟粉虱具有十分优良的生防潜力。     

Test performance study for detection of Ralstonia solanacearum and Clavibacter sepedonicus in potato tubers with TaqMan PCR

A test performance study (TPS) was organized in 2018 with ten official testing laboratories to evaluate the performance of different real-time PCR tests for the detection of Clavibacter sepedonicus and/or Ralstonia solanacearum in potato tubers. Participants were sent spiked potato extracts with low (0.8–1.2 × 10⁴ cfu mL^-1), medium (1.6–2.4 × 10⁵ cfu mL^-1) and high (1.6–2.4 × 10⁷ cfu mL^-1) bacterial loads, DNA extracts thereof and heel-end cores from symptomatic potato tubers. The four real-time PCR tests in this TPS for detection of C. sepedonicus were considered fit for purpose as principal screening methods. Two real-time PCRs in this TPS were considered fit for purpose as principal screening methods for detection of R. solanacearum. A third real-time PCR missed 23% of the DNA samples from low-level R. solanacearum spikes and is considered not fit for purpose as a principal screening method. Correct identification of spiked samples was lower when DNA extraction from the spiked samples was performed by the participating laboratories, highlighting the importance of appropriate DNA extraction protocols.     

生防多粘类芽胞杆菌P1悬浮剂的研制

本研究通过流点法、生物相容性、正交试验等方法,对多粘类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa P1悬浮剂（P1-SC）的配方所添加的助剂进行了筛选。结果表明,当P1-SC的配方为：P1菌粉为10%（≥10.18 lg cfu/g）、润湿分散剂500^#和MOA-7均为2.5%、增稠剂硅酸镁铝和黄原胶分别为0.75%和0.15%、防腐剂万立净C25 0.20%、防冻剂丙三醇3%、消泡剂0.3%、并用软水补足至100%时,所制得的P1-SC中的活菌数≥9.18 lg cfu/mL、细度（通过75μm筛）≥95%、pH在5.0～8.0、持久起泡量（1 min后）≤30 mL、倾倒后残余物质量≤5.0%、洗涤后残余物质量≤0.5%、悬浮率≥90%,达到了企业对悬浮剂的检测标准。同时,对P1-SC中P1芽胞在不同温度条件下的货架期进行了测定。6个月的贮存测试结果表明,45℃活菌数下降了6%,而在4℃和25℃ P1的活菌数没有发生明显变化。