玉米雄性不育基因Zmms1的同源克隆及生物信息学分析

利用水稻雄性不育相关基因Osms1同源克隆玉米中的同源基因Zmms1,用生物信息学方法对水稻Osms1及玉米Zmms1基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明,水稻雄性不育相关基因Osms1编码区长度为2 232 bp,编码679个氨基酸,Zmms1编码区长度为2 461 bp,编码670个氨基酸。通过对ms1蛋白功能结构域进行分析发现,Zmms1和Osms1同为PHD-ZF超家族成员,二者具有相同的功能结构域和近似的三级结构,因此推测,Zmms1可能与Osms1具有相似的功能。     

小麦 TaPLC1基因与耐热的相关性研究

小麦磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC,简称PI-PLC）在小麦抗逆过程中具有重要作用。为研究 TaPLC1基因与小麦耐热性的关系,选用热敏感型品种中国春(CS)和耐热型品种TAM107,在一叶一心期用PI-PLC抑制剂U73122处理,在两叶一心期进行40 ℃热胁迫处理,对小麦植株的部分生理指标（MDA、SOD、叶绿素和可溶性糖含量）及 TaPLC1基因的表达模式进行测定。结果表明,在两个品种中,抑制剂处理较未处理的幼苗叶片MDA、SOD及可溶性糖含量均升高,叶绿素含量下降,中国春的变化幅度大于TAM107。 TaPLC1基因在两个品种中呈现不同的表达模式,但表达量均在热胁迫30 min达到最大值。随着热处理时间的延长,未经抑制剂处理的TAM107叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度明显大于处理叶片,抑制剂处理的TAM107对热胁迫响应不显著;而未经抑制剂处理的中国春叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度与抑制剂处理的叶片差异不显著,均在一定程度上响应热胁迫;未经抑制剂处理的叶片,TAM107中 TaPLC1表达量的变化幅度明显大于中国春。热胁迫后,中国春幼苗出现明显萎蔫现象,TAM107轻微萎蔫,停止热胁迫后,全部幼苗萎蔫逐渐恢复,而抑制剂处理的幼苗叶尖开始枯萎变黄,热胁迫处理4 h后第5天表型较为明显,品种之间枯萎变黄程度无明显差异。以上结果说明,抑制 TaPLC1基因的表达后,幼苗对热胁迫的敏感性增强,TAM107和中国春的耐热性可能与 TaPLC1的表达有关。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

玉米ZmCPB1基因的克隆、表达及生物信息学分析

从玉米中克隆ZmCPB1基因的cDNA序列,全长1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质理论分子量为54.05 KD,等电点为8.59。生物信息学分析表明,ZmCPB1蛋白N端有跨膜结构,是跨膜蛋白。蛋白质二级结构含有48.44%的α-螺旋、4.99%的β-转角、10.60%的延伸链以及35.97%的无规则卷曲,该蛋白定位于内质网中。序列比对结果显示,ZmCPB1蛋白含有与子粒发育相关的保守区VKFVHRKALK。系统进化树分析表明,该蛋白与高粱、谷子、水稻和大麦的同源蛋白亲缘关系最近,同属一个亚支。实时荧光定量PCR分析ZmCPB1基因的表达模式,结果表明,ZmCPB1基因在3叶期的根、茎、叶以及雄穗和苞叶中表达量较低,在雌穗中的表达量较高。在玉米子粒发育的不同时期,ZmCPB1基因的表达量呈现一定的规律变化,在授粉后0～10 d,表达量逐渐达到最高峰,之后开始下降,在授粉15 d后降到较低水平。初步判断ZmCPB1基因与玉米子粒早中期发育有关。     

小麦种子萌发基因TaJAZ1的克隆和功能研究

小麦品种铭贤169是我国黄淮麦区育种研究广泛应用的条锈病诱发材料,但其种子休眠时间过长,不仅影响播种后均匀发芽和生长发育,其收获掉落籽粒也容易导致秋季育种田的生物学混杂。本研究通过筛选其休眠种子与萌发种子的转录组学数据,克隆获得差异表达基因TaJAZ1,并对其生物信息学特性、亚细胞定位、表达模式进行分析,结合解析拟南芥jaz3（与TaJAZ1同源性最高）突变体、TaJAZ1过表达拟南芥和水稻的表型反应。结果表明,TaJAZ1基因编码区全长1 230 bp,可编码409个氨基酸,在不同物种间保守性较强,与野生二粒小麦JAZ1基因的亲缘关系最近;启动子区含有脱落酸响应元件ABRE 和茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif;该基因定位于细胞核和细胞膜,TaJAZ1基因在种子发育中穗发芽时期表达量达到最高,进入成熟时期表达量显著降低;ABA能诱导TaJAZ1基因的表达,ABA处理下过表达拟南芥的萌发率比野生型和jaz3突变体高,ABA信号通路基因AtABI5的诱导量变低;TaJAZ1过表达水稻的萌发率高于受体水稻, ABA处理后,OsABI5的诱导量也降低。以上结果证明,TaJAZ1基因能促进种子萌发,进一步验证其在ABA信号通路中起负调控作用,为改良铭贤169等强休眠性小麦品种提供参考。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

大麦转录因子基因 HvNAC1的克隆及功能初探

NAC转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一,在植物的生长发育及植物参与生物与非生物胁迫过程中起重要作用。本研究通过分析感染大麦温和花叶病毒(Barley mild mosaic virus,BaMMV)的大麦转录组测序结果,获得表达上调的基因 HORVU5Hr1G011650,基因注释为 HvNAC1。通过生物信息学分析发现该基因全长915 bp,编码304个氨基酸,分子量为33.3 kDa,理论等电点为9.21,在14～141位氨基酸之间含有NAC转录因子家族保守结构域。系统进化分析发现,该基因与小麦、拟南芥中的NAC转录因子同源性较高。组织表达分析发现,该基因在大麦的不同生长时期均有表达,在结实后期和外颖壳中表达量较高。农杆菌介导的烟草亚细胞定位实验表明,该基因定位于细胞核中。在酵母实验中,发现 HvNAC1具有完整的转录因子活性。     

小麦TaPYL8基因的克隆与抗旱功能分析

脱落酸(ABA)信号通路在植物对干旱胁迫的响应中扮演着至关重要的角色;作为ABA受体,PYL家族蛋白在ABA信号转导中发挥核心作用。小麦TaPYL8是PYL家族的成员。为了明确TaPYL8是否参与小麦干旱胁迫响应,本研究分析了TaPYL8的表达模式,创建过表达TaPYL8拟南芥,并探讨了干旱对拟南芥生理生化及胁迫相关基因表达的影响。结果表明,TaPYL8表达量在干旱胁迫、外源ABA及PEG6000处理后上调。干旱胁迫下,过表达TaPYL8增强了拟南芥的存活率,降低了叶片失水率和MDA含量,提高了SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性及AtSOD、AtP5CS1、AtABF3等胁迫相关基因的表达量。推测TaPYL8通过促进胁迫相关基因表达增强植物抗旱能力。     

新疆杂草黑麦染色体核型分析

为了对新疆杂草黑麦的种质鉴定、起源分析、良种培育和遗传多样性研究提供依据,采用常规压片法制片结合显微摄影技术,分析了3个新疆杂草黑麦居群和1个栽培黑麦品种的核型并比较他们的异同点.结果表明,四种黑麦材料的染色体均为二倍体,染色体数目为14,不同材料之间染色体形态具有丰富的多态性.新疆杂草黑麦居群89R4的染色体核型公式为2n=2x=14=12m+ 2sm,除第7对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型不对称系数为61.70％,核型类型为1A型,属于基本对称型.新疆杂草黑麦居群89R14的核型公式为2n=2x=14=8m+ 6sm(2sat),除第5、6、7对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,其第7对染色体具有随体,核型不对称系数为60.88％,核型类型为2A型,属于基本对称型.新疆杂草黑麦居群89R60的核型公式为2n=2x=14=14m(2sat),其全部染色体均为中间着丝粒染色体,第3对染色体具有随体,核型不对称系数为60.47％,核型类型为1A型,属于基本对称型.栽培黑麦材料H36的染色体核型公式为2n=2x=14=10m+ 4sm,除第5、6对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型不对称系数为61.20％,核型类型为1A型,属于基本对称型.     

新疆杂草黑麦的光合特性分析及综合评价

为探究新疆杂草黑麦光合特性,筛选出高光效优异种质资源,对15个新疆杂草黑麦居群在开花期进行了光合参数的测定及分析。结果表明,新疆杂草黑麦居群间光合性状存在显著差异。通过主成分分析将5个光合性状简化为2个综合指标,分别反映光合能力和水分利用,可反映全部信息的88.67%。通过聚类分析将15个居群分为3大类,其中第Ⅲ大类的居群材料89R6、89R30、89R33、89R59、89R66的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用率均较高,其产量相关性状也表现较好,可作为麦类作物高光效种质加以利用。     

冬小麦miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因CSD1表达的调控

miR398是受逆境胁迫负调控的miRNA,其靶基因CSD编码超氧化物歧化酶(SOD),使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。为进一步了解低温胁迫下miR398的调控机制,从东农冬麦1号中克隆小麦miR398前体,构建过表达载体并转化拟南芥,用Real-time PCR检测T0代植株中小麦miR398及其靶基因CSD1在低温胁迫下的表达量。结果表明,随着低温胁迫时间的延长,miR398表达下调、CSD1基因表达上调,认为小麦miR398能响应低温胁迫、负调控CSD1基因表达,间接提高了拟南芥的抗寒性。     

玉米ZmFAR1基因的克隆与表达分析

FARs为脂酰辅酶A还原酶,在植物生长发育和抵御非生物胁迫过程中起着重要作用。为进一步研究FARs在玉米中行使的生物学功能,在玉米中克隆1个脂酰辅酶A还原酶1基因(ZmFAR1),该基因全长1 883 bp,开放阅读框长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为55.983 k Da。生物信息学分析表明,ZmFAR1蛋白的分子式为C₂₅₂₂H₄₀₁₀N₆₉₀O₇₀₁S₂₄,为稳定的碱性亲水蛋白,存在59个磷酸化位点,未发现信号肽,存在跨膜结构域,最大可能定位于细胞质。氨基酸残基组成中主要以α螺旋和无规则卷曲为主。系统进化树分析表明,ZmFAR1蛋白与南荻和高粱的FAR蛋白相似度最高。利用实时荧光定量PCR技术对ZmFAR1在模拟盐、干旱两种非生物胁迫条件下对根、茎、叶3种组织的表达模式进行研究,结果表明,ZmFAR1呈现组织特异性表达,在叶中的表达量最高。盐和干旱处理下,ZmFAR1的表达量出现明显变化,推测ZmFAR1可能在不同程度参与了玉米对非生物胁迫的应答。     

小麦TaNIP4-1基因的克隆及生物信息学分析

水通道蛋白不仅控制着水分和一些小分子溶质的跨膜运输,也是植物体应对非生物胁迫的重要组成部分。为了进一步研究小麦水通道蛋白的功能,本研究以NCBI和Ensemble Plant数据库中查找出的已报道的小麦水通道蛋白基因序列为模板,针对其保守区设计了19对引物,应用PCR的方法从5个小麦品种中克隆出19个基因片段。通过比对鉴定到一个此前未曾报道的新基因,并对其进行生物信息学分析,将其命名为TaNIP4-1。理化特性分析表明,该基因位于3A染色体短臂,基因全长1 315bp,CDS序列长度864bp,含有3个外显子和2个内含子,编码含有288个氨基酸的多肽,含有保守的沙漏模型,有6个跨膜区和2个保守的NPA基序。亚细胞定位预测结果表明该基因位于质膜上。该基因启动子序列含有与逆境响应相关的顺式调控元件,而对7日龄的麦苗进行干旱和盐胁迫处理后,其qRT-PCR结果显示,干旱和盐处理5h后,TaNIP4-1基因在小麦叶片中的表达量明显上调;盐处理7d后,TaNIP4-1基因在小麦根部的表达量显著上调。由此可见,TaNIP4-1基因参与了小麦应对逆境的过程。     

青稞法尼基转移酶β亚基编码基因HbERA1的克隆及表达分析

ERA1(Enhanced response to ABA)基因编码法尼基转移酶(Farnesyl transferase)β亚基,该酶在干旱胁迫下对ABA信号负向调控因子的修饰起着关键作用。本研究以青稞(Hordeum vulgare subsp.vulgare)抗旱品种喜马拉雅10号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了ERA1基因全长cDNA序列,命名为HbERA1(登录号:KJ699392)。生物信息学分析表明,该基因全长1 401bp,可编码466个氨基酸序列,蛋白分子量为51.14kD,等电点为5.00。Prosite Scan分析结果表明,HbERA1含有多个干旱胁迫响应蛋白的作用位点,如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点。利用实时定量PCR方法研究了HbERA1在干旱胁迫条件下及复水后不同时间点的表达情况,发现在水分过剩处理下(土壤绝对含水量15.5%),HbERA1在土壤绝对含水量为33.4%时表达量最高,并随着土壤绝对含水量的下降而下调表达;进行干旱胁迫后(15.5%)基因表达量也明显下调表达;复水后表达逐渐恢复,复水8h时超过正常表达水平,表明HbERA1基因可能参与调控水涝和干旱胁迫双重信号传导。     

小麦TaUCHs基因的克隆和特性分析

为研究小麦的耐盐机理,在以前的工作中,本课题组采用cDNA-AFLP技术获得一个219 bp的泛素羧基末端水解酶的片段,本研究以该片段为基础,通过电子延伸、RACE和RT-PCR,得到了两个全长cDNA克隆,分别命名为TaUCH1和TaUCH2,这两条序列在编码区只有一个氨基酸的差异。保守结构域预测显示,TaUCH1和TaUCH2的中部和C末端各有一个C19肽酶结构域。将TaUCHs及其在植物中的同源蛋白进行对比发现,TaUCHs与水稻中的同类蛋白相似性最高,有88%的同源性。Southern杂交显示,TaUCHs在小麦中以多拷贝或基因家族形式存在。以上结果说明TaUCHs是小麦中的羧基末端水解酶基因,可能参与了植物胁迫反应中某些受损伤蛋白或重要调控蛋白的降解。     

百萨偃麦草ThbGSK和 ThbHKT1基因的同源克隆与表达分析

百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum L(o)ve,2n=2x=14,JJ)是小麦改良的重要亲缘物种.为了解GSK和HKT1基因在百萨偃麦草耐盐胁迫中的作用,本研究采用同源克隆的方法从百萨偃麦草中扩增获得了糖原合成酶激酶基因ThbGSK及高亲和性钾离子转运蛋白基因ThbHKT1的全长cDNA,ThbGSK基因全长1 233 bp,与水稻、短柄草、小麦等物种的氨基酸一致性为93.92％～99.02％,表明GSK基因在这些物种间具有较高的保守性;聚类分析表明,ThbGSK与小麦TaGSK关系最近.ThbHKT1基因全长1 602bp,与水稻、小麦、短柄草、大麦等物种的氨基酸一致性为66.17％～92.87％,说明HKT1基因在这些物种间变异较大;聚类分析表明,ThbHKT1与大麦HvHKT1关系最近.RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,经250 mmol·L-1 NaC1胁迫处理后,GSK基因在百萨偃麦草和中国春诱导0～24 h的叶片中表现为组成型表达,而HKT1基因在百萨偃麦草和中国春中均表现为诱导后上调表达.