苹果属小金海棠MxIrt1基因特异性片段的原核表达及多克隆抗体的制备

 MxIrt1是从苹果属植物小金海棠中克隆出的二价阳离子转运膜蛋白基因。为进一步研究该基 因的功能, 利用MxIrt1基因位于第3和第4跨膜区之间的162 bp片段, 构建了原核表达载体pGEX-MxIrt1,经原核表达、亲和层析、获得GST2MxIRT1融合蛋白, 以融合蛋白为抗原, 制备多克隆抗体, ELISA方法检测抗体效价阳性, 蛋白质印迹检测植物体内总蛋白, 获得与预期大小一致的特异性条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。     

苹果AFS基因的克隆与原核表达

 通过RT-PCR扩增到苹果α - 法尼烯合成酶(α-Farnesene Synthase, AFS) 基因的编码区全长,将其克隆到pET-30a ( + ) 上, 构建了该基因的原核表达载体pET-AFS, 转化大肠杆菌BL21。SDS2PAGE检测结果表明, 此基因表达了1个约66 kD的蛋白, 1 mmol/L异丙基-β - D - 硫代半乳糖苷( IPTG) 诱导该基因高效表达, 6 h表达量最高, 诱导产物以包涵体形式存在。     

新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

杨树桑黄蓝光受体蛋白编码基因SvWC1的克隆及原核表达

对杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)蓝光受体蛋白编码基因Sv WC1进行克隆及原核表达,并利用定量PCR方法研究菌丝体在不同光照时间(0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、11 h)处理后,Sv WC1表达情况.结果 显示:Sv WC1全长为3074 bp,含有一个2937 bp...     

荔枝胚败育差异表达基因cDNA 片段的克隆及序列分析

 利用抑制消减杂交(Suppressive subtraction hybridization , SSH) 克隆荔枝败育胚的差异表达基因cDNA 片段。分别以荔枝‘桂味’正常发育胚为driver (驱赶子) , 败育胚为tester (检测子) , 建立差异表达cDNA 文库, 代表桂味败育胚特异表达的cDNA。经Virtual Northern 检测, 在桂味正常发育胚/ 败育胚差异表达cDNA 文库中得到3 个阳性克隆, 序列分析表明这3 个克隆对应的两个序列在荔枝中为首次报道。     

黄瓜促分裂原活化蛋白激酶基因的生物信息学分析及原核表达

利用RT-PCR技术结合RACE技术,从NO₃^-胁迫下的黄瓜根中克隆出促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）基因的同源序列,命名为CsNMAPK,GenBank注册号为DQ812086。生物信息学分析表明,该基因全长1 636 bp,开放阅读框（ORF）1 113 bp,编码370个氨基酸。亚细胞定位预测其编码蛋白可能定位于细胞质;跨膜结构分析表明该基因有一个强的跨膜螺旋结构;PlantCare分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、茉莉酸诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、伤害诱导等顺式作用元件。成功构建原核表达载体,并转化E.coli BL21（DE3）,SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约46 kD的蛋白。为进一步揭示黄瓜MAPK基因在NO3-胁迫中的作用奠定基础。     

甜樱桃DELLA蛋白基因PaGAI的克隆与表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术从甜樱桃（Prunus avium L.）嫩叶中克隆了赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白基因cDNA全序列,将其命名为PaGAI。该基因cDNA全长2 310 bp,开放阅读框ORF为1 788 bp,推测其编码一个含有595个氨基酸残基的多肽链,蛋白质分子量约64 kD。生物信息学分析结果表明,PaGAI编码蛋白具有DELLA蛋白保守结构域,其N端存在两个非常保守的酸性结构域DELLA和VHYNP作为信号感知区域,C端有VHIID、RVER 和SAW结构域作为阻遏区域。PaGAI与其它植物的DELLA蛋白具有较高的同源性,其中与苹果MdRGL2b蛋白同源性最高,达到84%。构建pGEX-4T-1/PaGAI原核表达体系,并转化E. coli BL21,经0.5 mmol · L-1 IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测获得了分子质量为91 kD的融合蛋白,半定量RT-PCR分析表明,PaGAI在花、果实、叶片、韧皮部中普遍表达,在花与韧皮部中的表达远远强于在果实与叶片中的表达。     

大叶补血草Na+/H+ 逆向转运蛋白基因( SOS1)的克隆与序列分析

 用RT-PCR及RACE方法从盐生植物大叶补血草Limonium gmelinii (Willd. ) Kuntze中分离出Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白基因的cDNA (LgSOS1, GenBank登录号EU780458) , LgSOS1的cDNA全长为3 910bp, 5′非翻译区为79 bp, 3′非翻译区为376 bp, 开放阅读框为3 455 bp, 编码1 151个氨基酸, 推测分子量为126 kD。氨基酸同源性分析表明, LgSOS1与冰叶午时花、沙拐枣、番茄、盐芥和拟南芥质膜型Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白的一致性分别为69.02%, 64.42% , 61.96% , 60.12%和59.62%。预测分析表明, LgSOS1有12个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白与质膜型的Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白的亲缘关系较近, 与液泡型的Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。     

切花月季ACC合成酶基因的克隆和原核表达

克隆了与伤害诱导相关的Rh-ACS1和与花朵开放进程及乙烯诱导相关的Rh-ACS3基因全长。结果表明,Rh-ACS1基因全长为2 132 bp,开放阅读框（ORF）长度为1 476 bp,推定编码491个氨基酸。Rh-ACS3基因的全长1 734 bp,ORF长度为1 545 bp,推定编码514个氨基酸。对这两个基因编码的蛋白进行原核表达分析,结果显示,在37 ℃条件下,0.6 mmol · L-1 IPTG诱导3 h后,携带Rh-ACS1 ORF和Rh-ACS3 ORF的原核表达载体分别在大肠杆菌中诱导生成了大量分子量约为70和60 kD的蛋白质,其大小与根据基因序列预测的理论值相一致。     

龙眼转醛醇酶基因的克隆与原核表达

转醛醇酶作为磷酸戊糖途径非氧化阶段的关键酶,在调节植物PPP对环境胁迫的应答中起重要作用.该研究应用RACE方法克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)花芽中转醛醇酶的基因,获得一段长度为1 655 bp的cDNA,其中包括一个1 320 bp的开放阅读框,已登陆GenBank,登陆号为FJ472991(GI:217795375).将转醛醇酶全长cDNA在大肠杆菌中表达,获得一个约55 kD带有组氨酸标签的外源蛋白.RT-PCR结果显示,TAL mRNA在龙眼成花逆转花芽中有较明显的表达量上调,说明TAL在一定程度上影响了龙眼正常成花.     

苹果apetala2同源基因的克隆和转化研究

 利用同源克隆的方法从苹果的花芽中分离出apetala2的同源基因MAP2。MAP2全长2 212 bp,编码549个氨基酸。分析表明, MAP2具有AP2家族典型的结构域, 是苹果的AP2同源基因。Southern杂交结果表明, MAP2在基因组中以低拷贝形式存在。采用RT-PCR的方法分析MAP2在不同组织中的表达,结果显示, MAP2在苹果营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达, 与拟南芥的AP2、矮牵牛的PhAP2A的表达模式一致。为确定MAP2在苹果中的生物学功能, 构建了35S∶MAP2正义表达载体, 并对‘皇家嘎啦’苹果进行了农杆菌介导的遗传转化。     

桃叶片β- 半乳糖苷酶基因全长cDNA克隆及原核表达

 利用RT-PCR和RACE技术, 从蟠桃(Amygdalus persica var. compressa Bean) 中克隆出3 285 bp的β - 半乳糖苷酶基因cDNA全长, GenBank登录号为AY874412。该cDNA 2 559 bp, 编码853个氨基酸。将其插入到大肠杆菌表达载体pET-32a ( + ) 中, 转化BL21 trxB (DE3) , 筛选重组菌株。经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE呈现约115 kDa特异表达条带。并通过体外酶促反应分析表达的融合蛋白的生物活性。     

苹果LEAFY同源基因的cDNA克隆与表达分析

 从苹果的果台枝顶芽中克隆了两个长约1.4 kb的cDNA片段，分别定名为AFL1和AFL2。它们的碱基序列在编码区有90%的同源性，但在3’末端非编码区仅有约印％的同源性。它们表达的肽链氨基酸序列与小叶杨、大豆、矮牵牛等有70％以上的同源性，与番茄、金鱼草、拟南芥有近70%的同源性，证明它们是LFY的同源基因。RT-PCR的结果表明，生长期AFL2在萼片、子房、根、茎、叶以及果台枝顶芽中都有表达，而AFL1只在果台枝顶芽中表达；在不同发育时期的果台枝顶芽中，AFL1在顶芽停止营养生长转向生殖生长以后才清晰表达，而AFL2在生长期6~10月都有表达。因此认为苹果中的这两个LFY同源基因虽有共同的起源，但是在功能上存在差异，在花和营养组织的发育中起不同的作用。DNA印迹分析表明，在苹果属及近缘的梨属植物中LFY同源基因是多拷贝的。     

黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的原核表达载体 的构建及表达分析

以先前克隆到的黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 全长的cDNA 为模板,用含有特异性酶切位点
的Yh1、Yh2 为引物,通过PCR 方法将黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的ORF 区构建到大肠杆菌表达载体
pGEX-4T-1 上获得原核表达载体p4t-LOX2,将该表达载体p4t-LOX2 转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）
中,获得相应的重组工程菌。在IPTG 诱导下,通过SDS-PAGE 电泳,得到一条约115 kD 的融合蛋白条带,
除去pGEX-4T-1 自身诱导的约26 kD 大小的GST 标签蛋白后,CsLOX2 编码一个约89 kD 的蛋白。 经过
融合蛋白表达体系的优化分析,表明该融合蛋白在 37℃,0.80 mmol·L^-1 IPTG 诱导表达 10.5 h,可获得
融合蛋白的最大表达量。     

苹果属小金海棠转录因子MxMYB1基因的克隆及其原核表达

 MxMYB1是苹果属小金海棠MYB类转录因子。MxMYB1含1个重复序列及MYB蛋白特有的氨基酸组成。酶切、PCR扩增及测序分析表明构建的原核表达载体结构正确, 未出现碱基突变及移码现象。1 mmol/L IPTG诱导2 h后, 在预期的蛋白分子量38 kD处出现1条表达加强的蛋白条带, 而未经诱导的转化子没有此蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。     

红肉苹果愈伤组织生长素信号相关基因MdARF3的克隆与表达分析

以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’F_1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,初步探讨生长素调控苹果花青苷代谢机理。根据拟南芥AtARF3蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个生长素信号相关基因(MDP0000173151),暂命名为MdARF3。克隆测序发现该基因的开放阅读框长度为2 127 bp,编码708个氨基酸。进化树分析表明,MdARF3与AtARF3在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。愈伤组织在含有0.3 mg·L~(-1) NAA的MS培养基培养2 h之后其MdARF3上调表达,表达量极显著高于无NAA培养基(对照),而CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT及LDOX等花青苷合成结构基因的表达量均极显著低于对照,并且MdARF3表达量与培养基中NAA浓度呈显著正相关(相关系数为0.98),与愈伤组织花青苷含量呈显著负相关(相关系数为–0.89),推测MdARF3对培养基中生长素快速做出反应调控花青苷合成;通过原核诱导获得了MdARF3的重组蛋白,为进一步研究MdARF3蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用双生病毒简并引物PA/PB,对山东寿光地区保护地疑似感染番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的番茄植株进行PCR检测,结果证明番茄病叶由TYLCV侵染所致。以提取的病叶总DNA为模板,扩增得到长约770 bp的TYLCV-CP基因片段,克隆至pEASY-T1 Simple载体,然后用Xho I和EcoR I将其切下并插入到pET-32a表达载体中,构建了寿光地区TYLCV分离物的外壳蛋白基因原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导获得了50 kD重组蛋白,Ni2+-NTA亲和层析纯化和Western印迹分析证明目的蛋白为TYLCV外壳蛋白,且具有良好的抗原活性。