柱状黄杆菌部分生物学特性的研究

采用革兰氏染色法、比色法和平板扩散法对柱状黄杆菌Flavobacterium columnare的部分生物学特性进行了研究。结果表明:用肉汤培养柱状黄杆菌24 h时,其形态多样,如半圆形、U型、V型或S型等;培养48 h时,柱状黄杆菌中开始出现颗粒状老龄培养物;培养72 h时,有部分菌体发生的分节现象,而老龄培养物也增多。用肉汤培养时,该菌的最佳生长条件分别是NaCl浓度为2.0 g/L,pH为7.4,温度为25～28℃。在最佳培养条件下,该菌的胞外产物具有蛋白酶、脂酶和卵磷脂酶活性,然而却检测不到淀粉酶、明胶酶和脲酶活性。     

柱状黄杆菌外膜蛋白的比较蛋白质组学研究

为了鉴定柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)的毒力相关因子,利用蛋白质组学方法分析了强毒株G4R3和弱毒株G18的外膜蛋白。双向电泳结合图像分析,共发现了8个差异表达的蛋白点。经过胶内酶解和质谱分析,其中的1个蛋白点被鉴定为LemA蛋白,它可能是柱状黄杆菌的一种毒力因子。     

柱状黄杆菌对草鱼TLRs基因表达水平的影响

用柱状黄杆菌Flavobacterium columnare G4株感染草鱼Ctenopharyngodon idella,分别在感染1、4、7 d后提取感染组和对照组草鱼鳃、脾脏、肝脏、肠道和头肾5种组织的总RNA,并采用半定量RT-PCR方法检测不同组织中Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体22(TLR22)3个抗病毒免疫基因的表达变化。结果表明:注射柱状黄杆菌7 d后,TLR3在草鱼鳃、肝脏、肠道和头肾4种组织中的表达显著上调(P<0.05);注射柱状黄杆菌4 d和7 d后,TLR7和TLR22在5种组织中的表达均显著上调(P<0.05);而注射柱状黄杆菌1 d后,TLR22在鳃、脾脏和肝脏组织中的相对表达量就显著上调(P<0.05)。研究表明,TLR3、TLR7和TLR22基因在机体应对细菌感染的免疫反应过程中发挥着重要的作用。     

柱状黄杆菌对草鱼TLRs基因表达水平的影响

用柱状黄杆菌Flavobacterium columnare G4株感染草鱼Ctenopharyngodon idella,分别在感染1、4、7d后提取感染组和对照组草鱼鳃、脾脏、肝脏、肠道和头肾5种组织的总RNA,并采用半定量RT-PCR方法检测不同组织中Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体22(TLR22)3个抗病毒免疫基因的表达变化.结果表明:注射柱状黄杆菌7d后,TLR3在草鱼鳃、肝脏、肠道和头肾4种组织中的表达显著上调(P＜0.05);注射柱状黄杆菌4d和7d后,TLR7和TLR22在5种组织中的表达均显著上调(P＜0.05);而注射柱状黄杆菌1d后,TLR22在鳃、脾脏和肝脏组织中的相对表达量就显著上调(P＜0.05).研究表明,TLR3、TLR7和TLR22基因在机体应对细菌感染的免疫反应过程中发挥着重要的作用.     

黄颡鱼源柱状黄杆菌的分离鉴定及其对翘嘴鳜的致病性

从患病黄颡鱼上分离出1株柱状黄杆菌(Pf1),对其进行分类鉴定和药物敏感试验。用Pf1感染黄颡鱼和翘嘴鳜,发现Pf1对2种鱼均有致病性。Pf1可导致翘嘴鳜多个组织细胞坏死和炎症反应,严重损伤肝、体肾和鳃。被感染翘嘴鳜肝细胞肿胀、空泡化坏死;肾小管广泛坏死和大量炎症细胞浸润;鳃小片毛细血管充血,呼吸上皮细胞肿胀变性,鳃的呼吸功能衰退。鳃部病变导致感染鳜呼吸频率加快、游动缓慢,最后大量死亡。     

大鲵柱状黄杆菌SYBR Green I 荧光定量PCR 诊断试剂盒的研制

根据GenBank中柱状黄杆菌16SrRNA 序列,设计1对特异性引物,PCR 扩增获得16SrRNA 基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了黄杆菌的SYBR Green I荧光定量PCR 诊断方法,以此为基础研制试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、迟缓爱德华、弗氏柠檬酸杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达12 拷贝/μL。结果表明,研制的柱状黄杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特征,适合于大鲵临床样品的检测。     

虹彩病毒和柱状黄杆菌混合感染大鲵的诊治

2012年7月,贵州省某大鲵养殖场发生了以大鲵体表和四肢多处溃烂、内脏器官出现充血、出血为特征的疾病,经过临床症状观察、病理剖检及实验室诊断,诊断为虹彩病毒(Iridovirus)和柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)的混合感染.通过采取综合有效的防治措施,大鲵疫情得到有效控制.     

大鲵柱状黄杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中柱状黄杆菌16S rRNA序列,设计1对特异性引物,PCR扩增获得16S rRNA基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品.通过对SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了黄杆菌的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制试剂盒.试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、迟缓爱德华、弗氏柠檬酸杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达12拷贝/μL.结果表明,研制的柱状黄杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特征,适合于大鲵临床样品的检测.     

斑点叉尾鮰烂鳃病病原柱状黄杆菌的分离及鉴定

[目的]对从斑点叉尾鮰烂鳃病中分离的病原菌进行分类学地位鉴定。[方法]采用人工感染确定其病原性,常规生理生化鉴定和16SrRNA基因序列分析方法进行分析。[结果]该菌株为革兰氏阴性杆菌,滑行运动,无鞭毛,菌体大小为(0.3～0.5)μm×(5～10)μm,过氧化氢酶反应阳性,不能发酵和利用葡萄糖等多糖,不水解酪氨酸,不产生吲哚。所测16SrRNA基因序列经BLAST分析表明,与GeneBank上登录的柱状黄杆菌的16SrRNA序列同源性最高,其相似性达98.2%。基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树表明,菌株GHS061212与柱状黄杆菌(AY841899)聚为1个分支,且置信度较高,为71.0%。[结论]菌株GHS061212被鉴定为柱状黄杆菌,这是国内首次报道斑点叉尾鮰烂鳃病病原为柱状黄杆菌。     

柱状田头菇菌丝营养特性研究

为提高生产中菌袋制作成品率，对柱状田头菇菌丝体的营养特性进行了研究。结果表明：柱状田头菇最适宜碳源为红糖，最适宜氮源为蛋白胨，pH值适应范围较广，但以5.5-7.5生长最好，菌丝生长最适宜温度为25℃。     

柑桔黑腐病菌生长和产孢生物学研究

本试验研究了柑桔黑腐病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｃｉｔｒｉ菌丝生长和分子孢子形成条件,结果表明：病菌在２７℃菌丝生长最快,在３０℃产孢最多;甘露糖是最好的碳源,Ｄ－缬氨酸是最好的氮源,Ｃｚａｐｅｋ培养基是菌丝生长最适宜的培养基,桔叶汁培养基是产孢的最适宜培养基。     

大球盖菇菌丝体生物学特性研究

对大球盖菇菌丝体生长的营养条件及环境条件进行了研究,结果表明:在试验范围内,乳糖为碳源时,菌丝干重最大,长势强壮,为最适碳源;最适氮源为黄豆粉,菌丝长速最快且菌丝干重最大;无机盐对菌丝生长影响较大,试验范围内测得最适无机盐为硫酸钙。同时对大球盖菇菌丝体生长的温度和pH值进行了研究,结果发现菌丝在15～30℃范围内均可生长,但不同温度条件下菌丝生长状况不同,在25℃时,菌丝长速最快,且干重最大,为最适生长温度。菌丝培养基pH值为5.0～8.0时均可生长,当pH值为6.0时菌丝干重最大,长速较快,最适宜大球盖菇菌丝生长。     

产几丁质酶香蕉枯萎病拮抗细菌的分离鉴定及生物学特性研究

为了筛选出对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的几丁质酶产生菌,以几丁质为唯一碳源进行几丁质酶产生菌筛选,然后通过平板对峙试验,从几丁质酶产生菌中筛选出1株香蕉枯萎病拮抗菌,通过形态特征和分子生物学分析,确定其为解淀粉芽孢杆菌并将其命名为DF.LB培养液测定的生长曲线显示24 h内该菌株生长达到稳定期;生物学特性数据显示该菌株在pH为5.15～8.94范围内生长良好,最佳pH为7.09;最佳碳源为甘露醇,最佳氮源为脲(尿素);拮抗试验可见病原菌菌丝发生膨大,凸起变形,原生质外漏造成菌丝中空干枯.     

TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）扩增菌株M165的aroA基因序列,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1 230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。     

TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列（摘要）

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA基因的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）扩增菌株M165的aroA序列基因,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列,具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。