抗麦草畏多克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立麦草畏的免疫分析方法,采用碳化二亚胺法将麦草畏(DIC)与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联,分别合成免疫原与包被原;用合成的免疫原免疫新西兰大白兔获得抗麦草畏多克隆抗体,该抗体效价为1∶1.28×105,且该抗体与麦草畏的结构类似物2,3,5-三氯苯甲酸、2,3,6-三氯苯甲酸、2-氨基-3,5-二氯苯甲酸的交叉反应率均小于0.1%。以包被原1∶8 000和多抗溶液1∶80 000的稀释倍数为工作浓度,建立麦草畏间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法,此方法检测麦草畏的线性范围为1～100ng.mL-1,线性回归方程为y=8.684 4ln x+15.001,R2=0.994 4,最低检测限为IC20=1.779ng.mL-1;玉米粉和面粉空白样品的麦草畏添加回收实验表明,麦草畏添加值为5～30μg.kg-1时,玉米粉中的麦草畏回收率为53.08%～92.37%,面粉的回收率则分别为66.5%～94.63%。     

磺胺母核抗原合成及多克隆抗体的制备

制备磺胺类药物母核结构的半抗原(H),通过免疫家兔得到多克隆抗体,为制备针对多种磺胺类药物的单抗和磺胺药检测免疫胶体金试纸条研制奠定基础。以对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)和对氨基苯甲酸甲酯(PA-BA)合成磺胺母核的半抗原(H);以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为载体,采用混合酸酐法,合成了免疫原H-BSA和包被原H-OVA通过紫外光谱定性证明偶联物偶联成功与否,以H-BSA免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法对其特异性及效价进行检测。成功合成了磺胺母核人工抗原即免疫原H-BSA和包被原H-OVA,二者的蛋白浓度分别为8.46 mg/mL和10.53 mg/mL,结合比分别为13∶1和9∶1;制备的多克隆抗体特异性良好,血清效价为1∶256 000。     

西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立

为建立一种特异、敏感、快速、准确的西马特罗(Cimaterol,CIM)残留检测方法,成功合成其完全抗原并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立其免疫学检测方法。应用重氮化法偶联西马特罗与载体蛋白BSA、OVA,合成免疫抗原CIM-BSA和检测抗原CIM-OVA,并采用UV、SDS-PAGE、质谱3种方法进行完全抗原的鉴定。用CIM-BSA免疫新西兰大白兔制备抗西马特罗多克隆抗体并建立间接竞争ELISA检测方法。结果表明,成功合成了西马特罗完全抗原,具有合成抗原的分子特征;免疫新西兰大白兔后,成功制备了抗西马特罗多克隆抗体,其效价为1∶64 000,对西马特罗的半数抑制质量浓度为4.26μg/L,与特布他林、莱克多巴胺、沙丁胺醇、齐帕特罗等β_2型受体激动剂药物无交叉反应。经过条件优化,建立了西马特罗间接竞争性ELISA检测方法,其最低检测限为0.04μg/L,在0.1～12.8μg/L检测范围内,线性关系拟合度为R~2=0.977 1,拟合曲线方程为y=-0.246 9x+0.662 3。检测猪尿和饲料样品,回收率分别为96.3%～103.9%和67.0%～105.0%。综上,成功建立了具有良好应用前景的西马特罗间接竞争ELISA免疫学检测方法。     

磺胺嘧啶多克隆抗体的制备

为制备磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)多克隆抗体(pAb),用重氮化方法将SD偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成免疫抗原BSA-SD和包被抗原OVA-SD。用紫外扫描、SDS-PAGE凝胶电泳试验检测,结果表明偶联成功。用BSA-SD免疫新西兰大白兔,间接ELISA测定多克隆抗体效价。阻断ELISA结果显示:SD单克隆抗体(pAb)的IC50达19.19ng/mL,和其他磺胺类药物交叉反应小于等于2.7%。结果表明,获得了高效价和特异的pAb。     

可食性动物组织中卡巴氧残留标示物ELISA检测方法的建立

将卡巴氧残留标示物喹喔啉-2-羧酸(QCA)与γ-氨基丁酸(ABA)衍生成喹喔啉-2-甲酰胺丁酸(QCA-ABA),再与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原(QCA-ABA-BSA),将QCA与卵清白蛋白(OVA)偶联作为包被原(QCA-OVA),建立了猪可食性组织中QCA的间接竞争ELISA检测方法。结果表明,最优的QCA-OVA包被抗原浓度为4μg/mL,抗体稀释倍数为1∶3.2×104,最适检测范围为0.2~51.2 ng/mL,最低检测限为0.6μg/kg,对猪肌肉和猪肝脏的添加回收率为47.4%~87.7%。     

沙拉沙星完全抗原的合成及多克隆抗血清制备

为了制备沙拉沙星(SARA)多克隆抗血清,采用碳二亚胺(EDC)法将SARA分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联,制备了免疫原SARA-BSA、包被原SARA-OVA。经SDS-PAGE电泳与紫外扫描初步判定偶联成功,然后用免疫原SARA-BSA分别按20、50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔3周,于最后1次免疫10d后断尾采血,制备多克隆抗血清。采用间接ELISA方法测定多克隆抗血清效价,间接竞争ELISA方法测定其敏感性和特异性。结果显示,制备多克隆抗血清效价均达1∶10 000以上,IC50为623.5ng/mL,且与其他药物交叉反应率低,具有较好的特异性。     

四环素全抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用Mannich反应合成四环素(Tc)与BSA(牛血清白蛋白)的完全抗原,由紫外光谱确定是否偶联成功;同理,制备四环素OVA抗原作为包被抗原,以制备的完全抗原TC-BSA免疫清洁级新西兰兔制备多克隆抗体,运用间接ELISA法测定血清抗体效价。试验结果表明,紫外光谱确定偶联成功,血清抗体效价为105,间接竞争法测定抗体50%抑制率(IC50)检测限为200ng/mL,最低检测限量可达到20ng/mL,特异性好。     

呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备与鉴定

制备了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-■唑烷酮(AOZ)的人工抗原,再采用重氮法将AOZ衍生物2-NP-AOZ与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA,通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析其偶联效果。以2-NP-AOZ-BSA皮下注射免疫SPF级BALB/c小鼠,分别于3次免疫和5次免疫后制备血清,以间接ELISA检测血清中2-NP-AOZ抗体效价,间接竞争ELISA检测血清敏感性,鉴定其免疫原性。发现2-NP-AOZ分别与BSA和OVA偶联成功,获得免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA;MALDI-TOF-MS分析测得偶联率分别为7.1∶1、3.8∶1;BCA试剂盒检测2-NP-AOZ-BSA、2-NP-AOZ-OVA的浓度分别为4.9、5.2 mg/mL。间接ELISA检测3次免疫后小鼠血清抗体效价均达1∶16 000及以上,5次免疫后血清抗体效价均达1∶32 000及以上;半数抑制浓度(IC₅₀)为34.43 ng/mL,人工抗原2-NP-...     

强力霉素单克隆抗体制备及ciELISA检测方法的建立

以人工合成的强力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)为抗原免疫BALB/C小鼠,用间接ELISA和间接竞争ELISA法选择细胞融合的备用小鼠;应用杂交瘤技术建立分泌DCMcAb的杂交瘤细胞株,用体内诱生法制备DCMcAb,并对DCMcAb的免疫学特性进行鉴定;应用DCMcAb建立检测DC的ciELISA方法,并对其相关特性进行检测.结果表明:筛选后获得1株分泌特异性抗体的细胞3D1-H4,细胞培养上清效价为1∶(8×102),腹水效价为1∶(5.12×105),抗体为IgG1型免疫球蛋白,与四环素、土霉素和金霉素分别有8.87％、5.86％和2.74％的交叉反应率,与其他抑制物无交叉反应性;ciELISA检测方法的线性范围为1.58～199.53ng/mL,灵敏度为2.88 ng/mL,半数抑制的质量浓度IC50为36.31 ng/mL,斑点叉尾(鲴)肌肉和肝脏样品中DC的平均添加回收率分别为85.13％和79.69％,平均批间和批内变异系数均小于15％,不同基质对检测结果影响小.所建立的ciELISA方法可以应用于水产品中DC残留的检测.     

伏马毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立

采用戊二醛法将半抗原伏马毒素B1分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和蛋白卵清白蛋白（OVA）偶联成为完全抗原KLH-FB1和OVA-FB1。OVA-FB1作为包被抗原建立ELISA方法;KLH-FB1作为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体。经三次亚克隆后,筛选出两株（6H3,6H11）能特异、稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选择其中一株杂交瘤细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体,经检测表明单克隆抗体的亚型为IgG1,轻链为κ型。采用间接ELISA测得腹水纯化后效价达l∶16 000,抗体对伏马毒素的半数阻断浓度（IC50）为8.26 ng/mL,对玉米赤霉烯酮、黄曲霉素B1等结构类似物几乎不存在交叉反应,与其他结构的氯丙嗪、链霉素等无交叉反应。利用获得的抗FB1单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA检测方法,检测灵敏度为0.44 ng/mL,检测线性范围为0.93~73.06 ng/mL,加标回收率在线性范围内达到回收率可达78.4%~102%。     

林可霉素人工抗原的合成与鉴定

拟合成并鉴定林可霉素( Lincomycin,LIN)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源LIN多克隆抗血清.采用高碘酸钠法将林可霉素与牛血清白蛋白(BSA)及鸡卵清蛋白(OVA)分别偶联,合成免疫原LIN-BSA和包被原LIN-OVA,并采用紫外分光光度法(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.结果表明,半抗原LIN和载体蛋白偶联成功.动物免疫试验(免疫BALB/c纯系小鼠)结果显示,3只小鼠效价均达1∶3 000,且2号小鼠多抗血清抗LIN的半数抑制质量浓度IC50为3.85 μg/L,与莫能菌素的交叉反应率为6.19％,与其他药物无交叉反应.表明成功获得高效价、特异性好、亲和力高的鼠源抗LIN多抗血清.     

一种新的抗多环芳烃多克隆抗体的制备（英文）

为实现环境中多环芳烃(PAHs)污染物的快速检测,制备了抗多环芳烃多克隆抗体,用于多环芳烃免疫学检测试剂盒的研制。采用活性酯法将半抗原芘丁酸(1-PBA)分别于牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,获得PBA-BSA和PBA-OVA偶联物,以PBA-BSA偶联物免疫新西兰大白兔,获得针对多环芳烃的抗血清。以PBA-OVA偶联物为包被原,间接ELISA法检测抗血清,效价为102 400,经纯化后得到多克隆抗体。采用间接竞争ELISA法绘制了针对芘的标准曲线,得到该方法的IC50值为0.06 mg/L,检出限为0.01 mg/L。与16种多环芳烃的交叉反应实验结果表明该抗体对高环PAHs的亲和力较高。反应体系中添加低于40%的甲醇对ELISA结果无影响。该抗体的制备及特性鉴定对后续多环芳烃酶联免疫试剂盒的开发奠定了技术基础。     

兔抗2,4-D多克隆抗体的制备

采用水溶性碳化二亚胺法(EDC),将2,4-D与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联,分别合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,经紫外分光光度计扫描鉴定。用合成的免疫抗原免疫新西兰大白兔,并用合成的包被原进行ELISA试验对抗血清进行定性定量测定,结果表明,获得的抗血清效价达1.6×105。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度(5μg/mL),抗血清最佳稀释度(1∶50 000),并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在50~2 000ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系,该法检测底限为50 ng/mL。     

碳二亚胺法制备阿莫西林人工抗原及其鉴定

合成、鉴定了阿莫西林(amoxicillin,AMO)人工抗原,并通过动物免疫法生产了亲和力高、特异性好的鼠源AMO多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将AMO分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成完全免疫抗原AMO-BSA和检测抗原AMO-OVA,经紫外分光光度法和SDS-PAGE以及动物免疫进行鉴定。结果表明,偶联后的紫外吸收峰与BSA和AMO相比都发生了一定的位移,AMO-BSA在276nm处出现最大吸收峰,BSA的泳动速度大于AMO-BSA。免疫后获得的3只小鼠多抗血清,通过间接竞争ELISA测定,效价可达1×10-4以上,1号小鼠半数抑制浓度(IC50)为573.75ng/mL,敏感性较好。AMO完全人工抗原的合成以及鼠源多克隆抗体血清的制备,为AMO单克隆抗体的制备奠定了基础。     

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

全氟辛烷磺酸酶联免疫检测方法的研究

以人工合成的全氟辛烷磺酸免疫原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,选择包被抗原浓度为0.1μg/mL,抗体稀释度为1∶8 000,建立酶联免疫(ELISA)检测方法。交叉反应试验结果表明,除全氟癸烷磺酸和全氟己烷磺酸的交叉反应率偏高(16.2%,14.22%)外,与其他全氟化合物交叉反应率低于10%,即该抗体有较好的特异性。PFOS检测限为10μg/L,该ELISA方法的最佳工作范围在10~1 000μg/L之间,在此范围内平均回收率为101.62%,平均变异系数为2.4%,表明该方法准确度和精密度高,便于在线检测,可应用于对水体中全氟辛烷磺酸残留的酶联免疫检测。     

除草剂2,4-D完全抗原的合成与鉴定

通过活化酯法和混合酸酐法,用牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)合成2,4-D免疫抗原和包被抗原,再分别采用紫外分光光度法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行鉴定.结果是:2种方法合成的完全抗原中2,4-D和蛋白质的偶联比分别为24:1和17:1,抗血清效价为1.28×104～2.56×104.     

盐酸金霉素人工抗原的合成及鼠源多抗血清的制备

采用碳二亚胺法将金霉素(chlortetracyline,CTC)偶联到载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)和OVA(鸡卵清蛋白)上,形成免疫原BSA-CTC与包被原OVA-CTC。通过紫外分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行抗原鉴定,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性。结果表明,在UV下出现了明显特征峰,BSA-CTC的峰与BSA、CTC相比均发生改变,表明半抗原与载体成功偶联。共免疫了5只小鼠,pAb效价均达到1×10-3,其中3号小鼠多抗血清抑制效价最低,IC50(半数抑制质量浓度)为71.47ng/mL。由此得出,获得了高效价、强特异的盐酸金霉素多抗血清,为盐酸金霉素单抗的制备奠定了基础。     

T2毒素人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定T 2毒素人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源T 2毒素多克隆抗血清。采用琥珀酸酐法将T 2毒素活化为T 2HS,T 2HS在碳二亚胺(EDC)作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联,合成免疫抗原T 2 BSA和检测抗原T 2OVA,经鉴定后,分别按30、50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后1次免疫10d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定其敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达到了1∶104以上,2号小鼠多抗血清的敏感性最好,其半数抑制质量浓度(IC50)为324ng/mL,且具有良好的特异性。成功合成了T 2毒素人工抗原,制备了多克隆抗体血清,为T 2毒素单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。