新城疫病毒F_（48）E_8株cDNA文库的构建

以ＳＰＦ鸡胚繁殖我国标准新城疫病毒Ｆ＿（４８）Ｅ＿８强毒株，经蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒。再以酚－ＳＤＳ法提取病毒基因组ＲＮＡ，作为反应模板、采用Ｐｒｏｍｅｇａ公司商品试剂盒合成双股ｃＤＮＡ。以同聚物加尾的方法将ｃＤＮＡ克隆到质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（一）中，经ＡＩＸ平板筛选，限制性内切酶分析和Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的核酸探针检测，共获得插入外源片段大小在０．６～４．８ｋｂ的阳性克隆７５个，初步构建了Ｆ＿（４８）Ｅ＿８株的ｃＤＮＡ文库     

玉米叶片cDNA文库构建及Cah墓因克隆

从玉米叶片中提取总ＲＮＡ后，再利用ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－纤维素亲合层析往，从中分离出ｍＲＮＡ，然后以ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－ＸｂａＩａｄａｐｔｏｒ作为引物，ｍＲＮＡ作为模板，合成相应的ｃＤＮＡ．并定向克隆进λＧＥＭ－４载体，构建出滴度为２×１０５ｐｆｕ的玉米叶片ＣＤＮＡ文库、最后，利用寡核苷酸探针，从ｃＤＮＡ文库中筛选到８个阳性克隆。     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ－２－ＵＫ分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

鸡IL—1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总ＲＮＡ为模板,据已报道的８种哺乳动物ＩＬ－１β核酸序列保守区设计合成１对引物,反转录合成ｃＤＮＡ链,经ＰＣＲ扩增,回收扩增后ＤＮＡ片段,用ｋｌｅｏｎｏｗ酶处理,与Ｐ＾ｕｃ１９／ＳｍａＩ连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌ＪＭ１０９,筛选出含有插入片段的重组质粒,用ＰＣＲ及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡了ＩＬ－１β片段的ｃＤＮＡ克隆,再经序列分析测定,得知此片段长为２７     

新城疫病毒F48E8株cDNA文库的构建

以ＳＰＦ鸡胚繁殖我国标准新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８强毒株，经蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒。再以酚－ＳＤＳ法提取病毒基因组ＲＮＡ，作为反就模板，采用Ｐｒｏｍｅｇａ公司商品试剂合成双股ｃＤＮＡ。以同聚物加尾的方法将ｃＤＮＡ克隆 粒ｐＧＥＭ ３Ｚｆ中，经ＡＩＸ平板筛选，限制性内切酶分析和Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的核酸探针检测，共获得插入外源片段大小在０．６－４．８ｋｂ的阳性克隆７５个，初步构建了Ｆ４８Ｅ８株     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA真核表达质粒的构建与鉴定

将组织型纤溶酶原激活剂基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。经酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,ｔ－ＰＡ基因的插向正确,可用于哺乳动物细胞和个体表达系统中表达。     

家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析

ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因分别位于ｅｇｔ基因的上游和下游．从ｐＵＡｃ－ｅｇｔ中分离出ＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩ１．１ｋｂ的ｅｇｔ基因片段，进行缺口平移标记，获得探针。与ＢｍＮＰＶＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ酶切、电泳、转移至ＮＣ膜的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，发现ＢｍＮＰＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢＤ片段呈阳性。从ＢｍＮＰＶ基因组中分离出１０．４ｋｂ的ＨｉｎｄⅢＤ片段，用ＥｃｏＲＩ酶切得到ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＩ２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩ１．４ｋｂ和ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ６．８ｋｂ３个片段，分别克隆于ｐＵＣ１９中，命名为ｐＵＨＥ２．２、ｐＵＥ１．４和ｐＵＥＨ６．８。经双链测序并与ＡｃＮＰＶ相关基因序列进行比较，发现ｌｅｆ－１基因被克隆于ｐＵＨＥ２．２中，ＤＡ２６基因克隆于ｐＵＥＨ６．８中。从所测定的ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因的启动子及５＇端部分序列来看，它们在ＡｃＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ之间有极高的同源性。     

肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因快速克隆和鉴定

以提纯的肠炎沙门氏菌染色体ＤＮＡ为材料,在一对含有ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡ的特殊引物引导下,应用ＰＣＲ扩增出鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ．ｍ,允１．８ｋｂ左右大小,然后以ＵＤＧ法快速克隆到质粒,ｐＡＭＰ１０中,转化第１宿主大肠杆菌ＴＧ１或大肠杆菌ＤＨ５ａ,在氨苄青霉素平板上筛选转化子,小量制备重组质粒ＤＮＡ,再转入第２宿主大肠杆菌ＬＣ－２ａ（ｈａｇ－,ｒｅｃＡ－）,所有转化子均出现动力。其中的一个克隆ｐ     

白粉菌诱导的小黑麦异多附加系M17特异cDNA克隆的研究

实验以对小麦白粉病菌免疫的小黑麦异多附加系Ｍ１７（１Ｒ″６Ｒ″） 为材料, 一组接种小麦白粉病菌,另一组不接种。分别提取两组叶片的总ＲＮＡ,分离出ｍＲＮＡ,在体外反转录合成ｃＤＮＡ,克隆进λｇｔ１０ 载体,得到了１ 个含９－８ ×１０４ 个重组子的ｃＤＮＡ 文库。两组ｃＤＮＡ 双链经切口平移法制成总ｃＤＮＡ 探针,分别与ｃＤＮＡ文库杂交,通过差别筛选的方法,找到了６ 个与小麦白粉病菌诱导有关的阳性克隆ｃＤＮＡ 克隆。将这６ 个阳性克隆用Ｈｉｎｄ Ⅲ和Ｂｇｌ Ⅱ进行双酶切分析,通过比较２ 个克隆酶切片段的差异,从１ 个克隆中找出１ 个约２－０ ｋｂ 的片段,此片段中包含约０－８６ ｋｂ 的外源ｃＤＮＡ 的片段。     

鸡Igλ轻链基因克隆、序列分析及其在COS7细胞膜上的定位表达

为了研究鸡B细胞膜免疫球蛋白(mIg)的功能,深入了解鸡免疫系统抗体基因的特点,从鸡法氏囊B细胞cDNA中扩增出Igλ轻链基因,对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析和比较。该基因cDNA全长873bp,编码含226个氨基酸的Igλ轻链,N-端21个氨基酸构成轻链信号肽,随后是2个Ig样结构域。运用融合PCR的方法将该基因与牛IgG Fc受体γRⅡ跨膜区序列嵌合形成重组跨膜分子,构建真核表达载体pcDNA-λR2T,转染COS7细胞,荧光抗体染色及流式细胞术检测到重组鸡Igλ轻链在细胞膜上的表达。所扩增的鸡Igλ轻链基因以及构建表达于细胞膜上的重组鸡Igλ轻链跨膜分子,为研究鸡免疫系统中的抗体轻链基因,探索Igλ轻链和B细胞膜免疫球蛋白的功能奠定技术基础。     

信号肽对鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白重组分子在COS7细胞上分泌表达的影响

分别将鸡Igλ轻链信号肽、小鼠纤溶酶原信号肽与pEGFP-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合,产生带有信号肽的中间载体pEGFP-SPc和pEGFP-SPm。对鸡Igλ轻链基因的定向克隆,构建了带有纯化标签的鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-SPc-λ和pEGFP-SPm-λ。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察及Western blotting检测融合蛋白的分泌表达,结果显示,鸡Igλ轻链信号肽能引导鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子的分泌表达;而小鼠纤溶酶原信号肽不具备引导该重组蛋白分泌表达的功能。表明信号肽在蛋白分泌表达中的关键作用,重组蛋白的分泌表达要选择合适的信号肽。     

喉癌细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

目的构建喉癌(Hep-2)细胞的酵母双杂交cDNA文库,为筛选包涵体膜蛋白分子的作用配体提供前期工作基础.方法从Hep-2细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的Hep-2细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库.结果所构建的文库展现出良好的多态性.结论可用于酵母双杂交系统的筛选.     

鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达.     

F4ac型产肠毒素大肠杆菌菌液上清对仔猪小肠 上皮细胞的免疫刺激作用

【目的】猪源产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是一类世界范围内流行的致仔猪腹泻的病原菌。依据养猪业生产实践中对致仔猪腹泻病原菌血清学鉴定结果可知,F4ac型ETEC的流行性最为广泛。到目前为止,对ETEC导致仔猪腹泻的机理已经有了比较透彻的阐释。但对ETEC培养液的免疫原性尚未有研究和描述。论文以F4ac型ETEC为研究对象,探索其菌液上清（即培养液）对仔猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）的免疫刺激作用。【方法】首先收集F4ac型ETEC菌株200培养12h后的培养液,后经4℃,4 000 r/min,离心15 min收集培养液上清,将该上清液经0.22 µm滤器过滤,并与DMEM/F12培养基以1﹕1的比例混合,以此混合液共孵育IPEC-J2细胞3 h,重复此处理3次获得处理组细胞;同时设新鲜的LB培养基与DMEM/F12培养基同样以1﹕1的比例共孵育3 h的IPEC-J2 细胞为对照组细胞,对照处理亦重复3次。然后用TRIZOL试剂按照说明书提取对照组和攻毒组IPEC-J2细胞的总RNA,并用TaKaRa 公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（反转录试剂盒）按照说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。应用文献报道或自行设计的跨内含子的引物通过实时荧光定量PCR方法,以猪的持家基因β-actin作为内参,检测IL8、TNF-α、CXCL2、IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13共9个免疫相关基因和黏蛋白基因在攻毒组和对照组中的mRNA表达差异性。【结果】较之对照组,在攻毒组中,3个重要的促炎细胞因子基因IL8、TNF-α和CXCL2的mRNA均出现了显著性地过表达。其中,在攻毒组中,IL8的表达量为对照组的3.24倍（P < 0.05）;TNF-α的表达量亦为对照组的3.24倍（P < 0.01）;CXCL2 的表达量为对照组的1.65倍（P <0.001）。在攻毒组和对照组之间,其他6个基因（IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13）的表达差异未达到统计学上的显著水平。【结论】研究采用F4ac型ETEC菌株200的培养液上清对IPEC-J2细胞系进行3 h攻毒处理,并通过荧光定量PCR方法检测到了3个重要的促炎因子基因IL8、TNF-α和CXCL2在攻毒组较之非攻毒组中的过表达。这表明猪F4ac型ETEC培养液上清对仔猪小肠上皮细胞确实具有一定的免疫刺激作用。研究为更明确地了解猪F4ac型ETEC释放的肠毒素及黏附素等抗原物质对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激作用提供了一定的实验证据。     

鲤鱼IL8的克隆及序列分析*

 利用DD-RTPCR（正常鲤鱼外周血白细胞和经有丝分裂源刺激后白细胞的总RNA）获得的差异显示片段B₁₀克隆（编码IL8的一段序列）,对该基因进行DIG标记,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×10⁴个重组噬菌体中,经过2轮筛选最终获得阳性克隆,挑选了3个分别命名为IL8-1,IL8-2,IL8-3。测序后经NCBI Blast分析表明,阳性克隆具有完整阅读框架,均为编码鲤鱼IL8的全长cDNA,编码的多肽由98个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为 10 848.9 Da,等电点为8.68。且与2003年12月Dev Comp Immunol.杂志报道的荷兰鲤鱼氨基酸的同源性达84%。     

雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒后免疫病理的研究

 研究了 1日龄 SPF雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒 ( REV)后 ,胸腺和脾脏 T细胞增殖反应及 T细胞数量、法氏囊和脾脏 B细胞增殖反应和抗体生成细胞数量、胸腺和脾脏 IL- 2及 IFN诱生活性的动态变化。结果发现 ,雏鸡感染 REV后 ,胸腺和脾脏 T细胞增殖反应及数量、法氏囊和脾脏 B细胞增殖反应和 Ig G+、Ig M+、Ig A+抗体生成细胞数量均明显低于未感染对照雏鸡 ;胸腺和脾脏 IL- 2及脾脏 IFN诱生活性显著下降 ,表明感染 REV后雏鸡中枢和外周免疫器官细胞免疫和体液免疫降低及细胞因子 IL- 2及 IFN免疫调节减弱。     

鸡IL-18重组真核表达载体的构建及其对ND灭活苗的佐剂作用

从pGEM-ChIL-18克隆质粒扩增获得鸡IL-18(ChIL-18)全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pChIL-18).经PCR、酶切和基因测序证实,所获重组质粒含有目的片段,且连接、构建正确.pChIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用.pChIL-18对ND灭活苗免疫增强作用的研究表明pChIL-18能够提高ND灭活苗诱发的细胞免疫应答,为后续基因疫苗的研究奠定基础.     

利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝试验测定病毒的血凝效价、测定蚀斑形成单位确定病毒滴度,从而证明病毒拯救成功。新城疫病毒Anhinga株的拯救成功为该病毒进行结构基因研究和疫苗研制奠定了基础。     

鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达及其抗病毒活性

[目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性。[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达载体转染293T细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染。[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx蛋白。