增效物质对核型多角体病毒AcMNPV的感染增效作用

由于昆虫病毒制剂与化学农药相比,其速效性较差,因而影响了其应用.因此,人们设想通过改造昆虫病毒来提高其杀虫效果,Merryweather将人工合成的蝎子毒素基因重组到苜宿尺蠖蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)中去,建立了重组病毒AcMNPVAaIT.将该重组病毒接种于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫,结果该幼虫取食量显著减少,发育不良,死亡时间缩短[1].为了提高昆虫病毒的感染能力,人们研究了感染增效物质,如硼酸、卵磷脂、阳离子表面活性剂等均具有感染增效作用.近年来研究表明,某种荧光增白剂对数种昆虫病毒具有感染增效作用.本研究应用野生型AcMNPV-C6和基因重组AcMN-PVAaIT经口感染东方粘虫(Pseudaletia separata),并添加感染增效物质,研究基因重组病毒与野生型病毒对东方粘虫的杀虫效果,以及感染增效物质的增效作用.     

抗对硫磷单链抗体在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9昆虫细胞中表达抗对硫磷单链抗体,并评价该重组抗体scFv-4C6的分子识别活性。以分泌能特异性识别对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C6为RNA来源,采用RT-PCR方法扩增抗体的重链和轻链可变区基因,经重叠延伸PCR方法串联拼接获得单链抗体基因片段(scFv-4C6)。构建包含目的片段的重组杆粒Bacmid-scFv-4C6,转染Sf9细胞表达目的蛋白,采用免疫印迹法(Western blotting)检测表达产物,间接竞争酶联免疫吸附(ic-ELISA)法评价产物的生物活性。结果表明:scFv-4C6基因片段拼装正确,成功转染Sf9细胞,并在转染后72 h表达量最高,表达的单链抗体大小为28.3 kD;表达产物能特异性识别对硫磷,IC50值为7.9 ng/mL,对甲基对硫磷和杀螟硫磷分别有12%和1.8%的交叉反应率,与亲本单克隆抗体的识别性能相似。该研究表明,具有生物活性的抗对硫磷单链抗体scFv-4C6可在昆虫细胞中成功得到表达。     

小菜蛾中肠氨肽酶N2在昆虫细胞中的表达

利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)表达获得小菜蛾 Plutella xylostella(L.)中肠氨肽酶N2(aminopeptidase N,APN2)蛋白,成功建立了该蛋白在昆虫细胞中的表达体系。将对Cry1Ac毒素敏感和已产生抗性的小菜蛾中肠APN2基因插入表达载体pFAST Bac HTB中,并在草地夜蛾 Spodoptera frugiperda 细胞系(Sf9)中进行了重组表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫印迹技术(Western-blotting)结果显示,在107 kDa处有1条特异性蛋白条带。研究表明,小菜蛾中肠APN2基因可在Sf9细胞中成功表达,这为继续研究其功能及抗性的关系奠定了基础。     

高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞自噬的诱导作用

采用噻唑蓝（MTT）染色、显微镜及透射电子显微镜观察、单丹磺酰戊二胺（MDC）荧光染色及蛋白质免疫印迹（WB）技术等方法,分别针对高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin）作用后草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞系Sf9细胞的细胞活力、自噬发生的典型特征及自噬相关蛋白变化情况进行了测试及分析。结果表明:经不同浓度高效氯氰菊酯处理后,对草地贪夜蛾Sf9细胞活性的抑制效应与作用剂量及时间呈现依赖关系,并表现出典型的细胞自噬现象;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比和Beclin 1蛋白表达量呈现上调趋势,分别为对照组的201.32%和136.00%,p62蛋白表达量下调至对照组的68.13%。研究表明,高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞具有显著的细胞毒性,并且其对细胞活力的抑制作用与自噬诱导途径相关。     

对草地贪夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株筛选与杀虫活性研究

草地贪夜蛾是一种世界性重大农业害虫，给玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重危害。为实现对草地贪夜蛾的高效、绿色、持续防控，亟需筛选高毒力苏云金芽胞杆菌菌株资源。本研究以前期实验室储备的对斜纹夜蛾、小地老虎具有杀虫活性的363株野生菌株库为候选菌株，基于菌株杀虫基因差异及进化关系，去除冗余菌株后获得172株候选菌株。通过培养获取这些菌株胞晶混合物，进行杀虫蛋白定量后，测定杀虫活性，获得27株对草地贪夜蛾初孵幼虫具有较高杀虫活性的菌株，其中菌株B14-D2的杀虫活性最高，LC₅₀为0.155 μg/g。克隆了该菌株中的cry1Ea3基因并在HD73^-无晶体突变株中表达，Cry1Ea3蛋白对草地贪夜蛾初孵幼虫LC₅₀为1.789 μg/g。本研究为新的Bt产品和杀虫基因的开发利用提供了丰富资源。     

禾谷镰孢菌β-1,3-葡聚糖合成酶催化亚基GLS2异源表达体系的建立

本研究旨在利用草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda昆虫细胞Sf9-杆状病毒表达系统筛选禾谷镰孢菌Fusarium graminearum β-1,3-葡聚糖合成酶催化亚基GLS2在昆虫细胞中的异源表达载体和分离纯化所用的去污剂，为后续研究该蛋白与药剂的结合模型提供基础。通过对杆状病毒表达质粒pFastBac进行设计和改造、利用同源重组的方法构建质粒、使用昆虫细胞表达系统对重组蛋白进行异源表达、筛选适合提取目的蛋白的去污剂等方法，得到适合禾谷镰孢菌β-1,3-葡聚糖合成酶催化亚基GLS2异源表达的载体和分离目的蛋白的方法。结果表明，载体pFastBac-GP67-8×His-GFP-TEV-FgGLS2、pFastBac-HA-8×His-GFP-TEV-FgGLS2、pFastBacGP67-6×His-2×Strep-TEV-FgGLS2和pFastBac-FgRHO-TEV-8×His均可在草地贪夜蛾昆虫细胞Sf9表达系统中进行表达，其中：GP67-8×His-GFP-TEV-FgGLS2融合蛋白可以用去污剂十二烷基二甲胺氧化胺(dodecyldimethylami...     

草地贪夜蛾取食诱导玉米叶片转录组分析

为阐明玉米响应草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda取食胁迫防御反应的分子机制,利用RNAseq技术对草地贪夜蛾取食的玉米叶片进行转录组测序分析,并对抗虫代谢产物生物合成途径中的基因进行筛选鉴定。结果显示,与未接虫对照相比,草地贪夜蛾取食18 h导致玉米叶片中有1 645个基因差异表达(log2|处理/对照|1且FDR0.05),其中上调表达基因有1 352个,下调表达基因有293个。茉莉酸、水杨酸、乙烯等植物激素生物合成与信号转导途径相关基因大多上调表达,其中44个茉莉酸途径相关基因全部上调表达,说明该途径在玉米响应草地贪夜蛾取食诱导的防御反应中发挥着核心作用,其它激素生物合成与信号转导途径发挥协同作用。玉米重要抗虫次生代谢物苯并噁唑嗪酮类生物合成相关基因中有9个基因上调表达;15个萜烯挥发物生物合成相关差异表达基因中有14个上调表达,包括8个萜烯合成酶基因和1个CYP基因CYP92C5。表明草地贪夜蛾取食会诱导玉米复杂的植物激素途径和基因调控机制,激活以次级抗虫代谢物合成为主的防御反应。     

对甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株筛选

依据对夜蛾科具有高毒力cry基因的序列,设计特异性引物对实验室保存的对鳞翅目害虫高效的菌株资源进行筛选。通过比较质粒图谱,对其多样性进行了研究。进一步测定Bt菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株。从192株菌株中筛选出15株对夜蛾科害虫具有高活性的菌株,包含的基因类型有:cry1A、cry1C、cry2A、cry9和vip3A类基因,晶体形态包含:双锥体形、方形、球形;其中2株菌表达130ku和60ku的蛋白,1株菌表达130ku和70ku的蛋白,其余菌株均表达约130ku的蛋白;这15株菌通过质粒图谱分析分为8种类型;3株菌对甜菜夜蛾幼虫具有高毒力,其中菌株PS3-C2对甜菜夜蛾LC50为1.87μg/mL。本研究成功筛选出对甜菜夜蛾具有高毒力的菌株3株,其中PS3-C2菌株与对照菌株KN11活性相当,为新型杀虫基因分离克隆与制剂的研发奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、cry2Ab和一种新的cry1类基因,SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达,在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因,并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段(1.95kb)插入表达载体pET-21b,转化EscherichiacoliRosetta(DE3)菌株,表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性,LC50分别为100.74μg/mL和29.87μg/mL,进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

东革内酯通过InR-PI3K-mTOR-Bcl-2通路诱导斜纹夜蛾卵巢细胞凋亡

本文研究了东革内酯抑制斜纹夜蛾卵巢细胞(SL-221)增殖及凋亡的机理。首先,采用CCK-8法检测东革内酯对细胞增殖的抑制率;其次,利用流式细胞术测定东革内酯对SL-221细胞周期、凋亡和线粒体膜电位的影响;最后,通过RT-qPCR技术检测凋亡相关基因SL-p53、SL-Cytochrome C、SL-InR、SL-Bcl-2、SL-mTOR和SL-PI3K的mRNA表达情况。结果表明：东革内酯对SL-221细胞有明显的增殖抑制活性,且与浓度呈正相关,48 h的IC₅₀为1.98μg/mL;流式细胞术检测到东革内酯可将SL-221细胞周期阻滞于G2/M期,降低线粒体膜电位,同时诱导细胞凋亡;RT-qPCR检测发现东革内酯可诱导凋亡标志基因SL-p53、SL-InR和SL-Cytochrome C的表达显著上调(P<0.05),同时抑制凋亡抑制因子SL-Bcl-2的表达,而细胞凋亡信号通路上游的SL-mTOR和SL-PI3K基因表达均显著下调(P<0.05)。综上,东革内酯可显著抑制SL-221细胞的增殖活性,并通过InR-PI3K-mTOR-Bcl-2...     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

两种蜘蛛毒素肽与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白的融合表达及杀虫活性

蜘蛛毒液中含有多种杀虫肽,因而具有较强的杀虫作用,可迅速杀死农林害虫。蜘蛛毒素肽（ω-ACTX-Hv1a,ω-ACTX-Hv2a）是从澳大利亚的多能厚爪蛛Hadronyche versuta的毒液中分离获得,对昆虫有毒但对哺乳动物无毒。本文通过将人工合成的两种蜘蛛肽基因（hv1a、hv2a）与来源于对棉铃虫具有高活性的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）野生菌株NBIC380中的杀虫基因cry1Ac进行融合并在NBIC380中表达,获得了7种不同的重组菌株BtBM-Ve（含有空表达载体）、BtBM-Ac（含有cry1Ac基因）、BtBM-1a（含有hv1a基因）、BtBM-2a（含有hv2a基因）、BtA1a（含有cry1Ac+hv1a融合基因）、BtA2a（含有cry1Ac+hv2a融合基因）和BtA（1+2）a（含有cry1Ac+hv1a+hv2a融合基因）。重组菌分别进行了棉铃虫Helicoverpa armigera 2龄幼虫、秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans和朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的生物活性测定,结果显示BtBM-Ve无杀虫增效作用,BtBM-Ac、BtBM-1a、BtBM-2a、BtA1a、BtA2a和BtA（1+2）a针对不同的虫源具有不同的杀虫增效活性,对3种害虫杀虫增效最多的重组菌是BtA（1+2）a,对棉铃虫2龄幼虫杀虫增效百分比为93.43%,对秀丽隐杆线虫为34.48%,对朱砂叶螨为13.46%。本文构建的基因工程菌对防治鳞翅目害虫、螨虫和线虫具有重要的理论意义和应用前景。     

对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌菌株的分离及鉴定

从我国3种典型植被覆盖的6个地区的土壤样品分离得到了348株苏云金芽孢杆菌菌株,采用杀虫活性测定方法从中获得了32株对小地老虎具有高毒力的菌株。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析法,研究了这32株苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因类型和晶体蛋白表达情况,对小菜蛾、二化螟、棉铃虫的杀虫活性测定也证明了苏云金芽孢杆菌cry基因类型、表达蛋白及杀虫活性间的相关性。     

苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11蛋白C端点突变对其杀虫活性的影响

为研究Vip3Aa11羧基端对其杀虫活性和敏感性的影响,本研究利用定点突变技术构建了Vip3Aa11的3个突变体S543N、D547E和T681V。经SDS-PAGE分析证实3个突变体蛋白均能在大肠杆菌中表达分子量约88 kD的目的蛋白,生物活性测定显示,与Vip3Aa11相比,突变体S543N对甜菜夜蛾Helicoverpa armigera的杀虫活性提高了5倍。突变体D547E对甜菜夜蛾杀虫活性显著降低。突变体S543N、D547E和T681V对棉铃虫Spodoptera exigua的杀虫活性无明显变化。说明Vip3Aa11 C端部分氨基酸的定点突变对其杀虫活性有影响,且对不同害虫的杀虫活性变化趋势不同。本研究比较了Vip3Aa11蛋白与突变蛋白之间杀虫活性的差异,为研究Vip3Aa类蛋白的结构和机理奠定基础。     

转Bt 基因抗虫玉米对棉铃虫杀虫活性的初步评价

国内外在转 Bt基因抗虫作物的研究和应用上已取得重大进展 ,其中 Bt抗虫棉已在美国、澳大利亚、中国等进入商品化应用阶段 ,近年来种植面积增长很快 ,并取得了显著的经济、生态和社会效益。 1 997年下半年 ,我国农业部分别批准了孟山都公司申报的保铃棉○R在河北省商业化生产和 Bt玉米在我国多省份的田间种植。其中保铃棉 ○R已由河北省定名为新棉 33B,1 998年在全省实际种植了近 1 0万 hm2 ,1 999年的种植面积已达 1 5万 hm2 。我国自主研制的 Bt抗虫棉也于 1 998年开始商品化应用 ,当年种植面积即达 1 0万 hm2以上 ,1 999年推广总面积…     

Chromosomal Location of Genes for Resistance to Puccinia striiformis in the Wheat Line TP1295 Selected from the Cross of Soissonais-Desprez with Lemhi

Crosses of a wheat line TP1295 with the cultivar Chinese Spring monosomic series were used to locate, on chromosome 1D, a major gene for resistance to isolate WYR 85-22 of race 6E0 of Puccinia striiformis. The gene is designated as Yr25 and is probably present in several of the cultivars currently widely used for differentiating races of this pathogen. The expression of the gene was modified by the environment and by at least one minor gene which may be located on chromosome 6A. In F2 and F3 generations from a cross between TP1295 and euploid Chinese Spring, a wide range of variation in infection type (IT) was observed. This precluded the classification of the plants as either resistant or susceptible, so they were assigned to 6 classes and analyzed by factorial correspondence analysis and non-hierarchical classification. When all F3 plants in a family were fully resistant, like TP1295 itself (IT ;), both Yr25 and the modifying gene were assumed to be present and homozygous. In environments favourable to expression of the gene, families thought to carry Yr25 alone had a distribution of ITs from fully resistant (IT ;) to intermediate (IT 2, rarely 3 or 3+). This F3 analysis indicated that use of IT data alone, in the monosomic analysis, would not reveal the chromosomal location of the genes and that chromosome counting of numerous plants was necessary. As well as indicating the chromosomes carrying the genes for resistance to isolate WYR 85-22, the data showed that plants monosomic for chromosomes 5B and 5D were more resistant than the corresponding disomics, indicating that these chromosomes promote susceptibility and supporting other evidence of the effects of these chromosomes on yellow rust resistance.     

苏云金芽孢杆菌及其δ-内毒素基因的分类与鉴定

苏云金芽孢杆菌作为重要的杀虫微生物在生物防治中发挥了巨大作用。其分类鉴定对于研究资源的多样性、快速筛选优良菌株、预测其杀虫活性、分离克隆新的Btδ-内毒素基因等方面具有重要意义。本文对Bt菌株的分类、δ-内毒素基因分类、鉴定方法进行了分析讨论。     

四株对小地老虎有活性的苏云金芽胞杆菌的毒力评价

本文对4株苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）的杀虫基因类型、杀虫蛋白表达类型、蛋白表达量以及杀虫活性进行了初步的评价分析。菌株PS9-D12和PS9-C12的基因类型与蛋白表达类型丰富,且其杀虫蛋白表达量是对照菌株HD-1的1.7倍。在相同培养条件下,制备菌株胞晶混合冻干粉对小地老虎Agrotis ypsilon的生测结果显示,菌株HD-1、PS9-D12、PS9-C12、PS9-D11和PS9-H9的LC50分别为0.71、0.19、0.14、0.24和1.16 mg·g^-1,菌株PS9-D12和PS9-C12的杀虫活性显著高于菌株HD-1（P〈0.05）;此4株菌株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫的校正死亡率均大于78%,它们对甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫的活性均高于菌株HD-1;而对大猿叶甲Colaphellus bowringi幼虫均无活性。可见菌株PS9-D12和PS9-C12比商业化生产的HD-1有更好的杀虫活性,可作为Bt杀虫剂的候选材料。     

类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的影响

将克隆的黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达纯化,并分析其对Cry3A毒素杀虫活性的影响,从而探讨黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的增效作用。黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达产物为包涵体,经尿素变性后,用亲和纯化法可得到较纯的重组蛋白;随着类钙粘蛋白片段与Cry3A质量比值的升高,Cry3A毒素对黄粉虫的杀虫活性也逐步提高,当其比值为1时,活性达到最大,提高了2.5倍,而黄粉虫类钙粘蛋白片段对Cry3Am的杀虫活性却没有显著性影响。研究表明,黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素的杀虫活性具有增效作用。     

Cyt1Aa protein from Bacillus thuringiensis (Berliner) serovar israelensis is active against the Mediterranean fruit fly,Ceratitis capitata (Wiedemann)

BACKGROUND: Ceratitis capitata (Wiedemann) is one of the world's most destructive fruit pests. The aim of this study was to ascertain insecticidal activity of Bacillus thuringiensis (Berliner) δ‐endotoxins to C. capitata. RESULTS: Among 42 selected Bacillus strains, only B. thuringiensis serovar israelensis (Bti) solubilised protoxins showed biological activity against C. capitata neonate larvae, whereas Bti spore and crystal mixture was inactive. Insecticidal activity of Bti protoxins was significantly enhanced by incubation with Culex pipiens L. gut extracts. Overdigestion of Bti protoxins with Sesamia nonagrioides (Lefebvre) gut extracts suppressed biological activity against C. capitata, and this correlated with degradation of Cyt toxins. Cyt1Aa solubilised protoxin showed the highest toxicity, LC₅₀ after 7 days of 4.93 µg cm^?2, while proteolytical processing of Cyt1Aa protoxins by larval gut extracts did not enhance insecticidal activity. CONCLUSION: The present study provides evidence for the first time of the insecticidal activity of a B. thuringiensis strain against C. capitata and identifies a single δ‐endotoxin with potential for controlling this pest. Copyright © 2010 Society of Chemical Industry