波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌致腐性及TorA还原酶差异比较

为了研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异,本实验比较分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28℃和4℃下的生长及三甲胺（TMA）、生物胺和挥发性盐基氮（TVB-N）的生成;通过PCR技术扩增2种腐败菌的氧化三甲胺还原酶基因（torA）,利用生物信息学比较TorA蛋白的相似性、理化特性和蛋白空间结构。结果显示,杀鲑气单胞菌在28℃生长较快,而波罗的海希瓦氏菌在4℃生长更快。相对于杀鲑气单胞菌形成较高的尸胺,波罗的海希瓦氏菌产生更多TMA和腐胺,在冷藏鱼汁中积累更高TVB-N。同时在波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌中分别扩增出2 490和1 959 bp的torA基因,2种TorA蛋白与同属菌相似性高于97%,而二者相似性仅为36.90%。波罗的海希瓦氏菌TorA蛋白的分子量和等电点分别为92.3 ku和6.52,甘氨酸含量最高,而杀鲑气单胞菌中TorA蛋白的分子量和等电点分别为90.6 ku和6.74,丙氨酸含量最高,蛋白结构差异明显。且希瓦氏菌中torA 和鸟氨酸脱羧酶（DOC）基因表达量分别为气单胞菌的1.26和19.04倍。可见,波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌为海产品嗜冷腐败菌,其中希瓦氏菌胺类代谢能力更强,与其TorA特定理化特性和高表达量相关。本研究为揭示海产品微生物的致腐机制提供理论支持。     

黄海希瓦氏菌胞外产物特性研究

为研究黄海希瓦氏菌(S. smarflavi)AP629胞外产物(ECPs)的致病性,用平板玻璃纸法提取胞外产物。结果显示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)发现ECPs蛋白条带主要在114 kDa、66 kDa、39kDa、36 kDa、79 kDa;ECPs具有酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂蛋白酶和脂肪酶活性,无明胶酶活性;一些金属离子和化学试剂对菌株AP629ECPs的酶活有影响,EDTA、PMSF、SDS、MnCl_2作用浓度分别为10、5、5、5 mM时,ECPs酶活受到不同程度抑制;Ca~(2+)和Mg~(2+)则提高ECPs的酶活,可分别提高3%～19%和12%～28%的酶的活性。菌株AP629的胞外产物人工感染小白鼠和仿刺参试验结果表明,黄海希瓦氏菌AP629的胞外产物不显示致病性。该文为揭示黄海希瓦氏菌AP629发病机理奠定了基础。     

鲢腐败希瓦氏菌株的16S rRNA鉴定

从患病鲢(Hypophthalmichthys molitrix)体表分离获得1株革兰氏阴性细菌,菌株编号为BD1-5,通过细菌形态学观察、革兰氏染色镜检、16S rRNA序列分析以及构建系统发育树分析等进行鉴定研究.结果表明,患病白鲢体表皮肤溃烂,尤其尾部溃烂严重;对该病例主要组织进行镜检未见明显寄生虫;分子生物学检...     

3株方斑东风螺病原希瓦氏菌对35种常用抗菌药物的敏感性试验

采用K-B法,测定腐败希瓦氏菌、鲍鱼希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌3株方斑东风螺病原希瓦氏菌对35种常用抗菌药物的敏感性.结果显示:腐败希瓦氏菌对大观霉素、氯霉素、头孢吡肟、诺氟沙星、链霉素、复方新诺明6种抗菌药 物敏感;鲍鱼希瓦氏菌对头孢吡肟、大观霉素、头孢噻肟、氨曲南、头孢他啶、头孢西丁、头孢曲松、红霉素、哌拉西林、头孢哌酮、米诺环素、克拉霉素、多粘菌素B、妥布霉素、庆大霉素15种抗菌药物敏感;海藻希瓦氏菌对大观霉素、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星、头孢噻肟、头孢曲松、红霉素、氧氟沙星、左氟沙星、头孢他啶、头孢呋辛、氯霉素、哌拉西林、克拉霉素、诺氟沙星、米诺环素、复方新诺明、链霉素、呋喃妥因、庆大霉素、多粘菌素B21种抗菌药物敏感.     

冷藏养殖大黄鱼细菌相组成和优势腐败菌鉴定

从菌落和细胞形态、生理生化特征、细胞脂肪酸组成及同源性分析等方面,结合使用Sensititre、BioFosun、MIDI细菌鉴定系统对0 ℃、5 ℃冷藏养殖大黄鱼货架期终点细菌相进行定性和定量研究,确定优势腐败菌。0 ℃、5 ℃冷藏优势菌为腐败希瓦氏菌,比例分别为75.5%、59.6%,在营养琼脂和胰酶解大豆胨琼脂培养基上菌落圆状隆起,边缘整齐,透明,无色至粉红色,革兰氏阴性杆菌,极生单鞭毛,大小为(0.6～0.9) μm×(1.5～3.3) μm,最适生长温度25～35 ℃、最适pH 7～9。菌株氧化酶和H2S呈阳性,能还原TMAO、液化明胶和Tween40,利用N乙酰基D葡萄糖胺等有机物。菌体主要脂肪酸为16∶1ω7c 、iso15∶0、17∶1ω8c、16∶0,比例分别为21.31 %、13.63%、9.82%、9.76%。菌株测试特征与细菌鉴定系统数据库比照,确定优势腐败菌为腐败希瓦氏菌。     

网箱养殖大黄鱼诺卡氏菌病的初步研究

首次报道了大黄鱼诺卡氏菌病的发生情况。病鱼以体表和心、脾、肾等内脏出现白色结节为主要症状,平均死亡率15％。对病鱼进行细菌分离培养和光镜、电镜检查,均发现长或短的丝状分枝状杆菌。用分离菌株作回归感染,证实为该大黄鱼结节病的病原菌。对病原菌的基本生物学特性进行了研究,确定病原为诺卡氏菌。     

海水网箱养殖大黄鱼诺卡氏菌病及防治

2003年9～11月,在浙江台州大陈岛海水网箱养殖大黄鱼出现了一种以体表和脾、肾等内脏出现白色或淡黄色结节为主要症状的疾病,该病危害严重,持续时间长,造成大批鱼死亡.但目前国内外还没有大黄鱼该病的报道,经细菌分离培养和光镜、电镜观察,均发现长或短的丝状分枝状杆菌.根据病鱼的症状及病原菌的基本生物学特性初步断定为诺卡氏菌病。     

比较基因组学分析鱼源荧光假单胞菌的致腐和适应性

为探究荧光假单胞菌的强致腐和环境适应性,实验通过分析2株海水鱼源荧光假单胞菌的蛋白酶活性和挥发性盐基氮(TVB-N)的形成,并采用比较基因组学方法解析致腐和适应机制。结果显示,荧光假单胞菌PF07和PF08在冷藏鱼汁中的蛋白酶活性强,积累较多TVB-N。经全基因组测序、组装和功能注释后,得到PF07基因组长度为6.13 Mb,GC含量61.4%。通过泛基因组分析可知,PF07与PF08核心基因共4 980个,独特基因分别有516和470个。COG和KEGG注释显示2株致腐菌基因组中参与氨基酸代谢基因占比最高,PF07独特基因参与无机离子转运代谢居多。碳水化合物活性酶CAZy注释表明,2株荧光假单胞菌基因组中糖苷转移酶与糖苷水解酶基因均占比最高,还鉴定得到大量分解碳水化合物、蛋白质和脂质等多种底物的酶和相关蛋白基因,特别有碱性金属蛋白酶AprA、多胺ABC转运蛋白渗透酶PotC、精氨酸与鸟氨酸脱羧酶等多种降解蛋白酶。另外,2株致腐菌分布有rpoS、rpoN和rpoD多种σ因子。2株鱼源荧光假单胞菌表现出强的致腐性,研究通过比较基因组学方法解析荧光假单胞菌分布多种编码蛋白酶和腐胺形成的氨基...     

大黄鱼源气单胞菌的分离鉴定及致腐表型

为鉴别大黄鱼腐败菌气单胞菌的致腐能力,采用生理生化和分子方法(16S r RNA)鉴定冷藏大黄鱼货架期终点不产H2S的菌株。分析菌株在体外培养条件下的生长、胞外酶活性、三甲胺(TMA)和生物胺形成的腐败表型,将菌株接种在灭菌鱼汁中测定其致腐能力。结果显示,分离株AE03和AE04在0~37°C及0~60的盐度下生长良好,在4和25°C条件下AE03菌株的生长速率显著高于AE04菌株。2株细菌不产H2S,能还原氧化三甲胺(TMAO),分解尿素和液化明胶,氧化酶、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶等都呈阳性,能利用葡萄糖。结合16S r RNA鉴定发现分离株AE03为杀鲑气单胞菌,AE04为软体动物气单胞菌。在体外培养中,2种气单胞菌均能产生蛋白酶、形成TMA和生物被膜,其中AE03菌株生成各指标的能力高于AE04菌株,同时AE03菌株还具有脂酶活性,产生生物胺,其中尸胺含量较高。气单胞菌AE03在灭菌鱼汁中产生的挥发性盐基氮(TVB-N)显著高于AE04。通过紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136 2种报告菌检测发现,2株气单胞菌是高丝氨酸内酯(AHLs)产生菌,其中AE03菌株产生的AHLs含量显著高于AE04菌株。研究表明,杀鲑气单胞菌AE03为冷藏大黄鱼的强致腐菌,且能分泌高含量的AHLs,研究为从群体感应角度阐明气单胞菌的致腐机理奠定了良好的基础。     

采用Illumina MiSeq测序技术比较日本鲭和大黄鱼冷藏期间的腐败特性

为比较日本鲭和大黄鱼肌肉中微生物和代谢功能的变化及其与鱼肉腐败特性之间的关系,本研究检测了2种鱼在冷藏过程中的理化指标和菌落总数的变化,利用Illumina Miseq测序技术分析细菌群落变化,并利用皮尔森相关性分析检验微生物与鱼肉腐败及组胺产生相关性,结合功能预测分析细菌群落组成与代谢功能之间的关系。结果显示,冷藏期间日本鲭和大黄鱼的pH、挥发性盐基氮、组胺、菌落总数等均呈上升趋势,且日本鲭上升较快;冷藏末期2种鱼TVB-N值和组胺含量分别达到76.34、59.98和59.92、3.11 mg/100 g;日本鲭肌肉中细菌丰富度和多样性先增加后减少,大黄鱼则整体呈下降趋势;2种鱼肌肉中的优势腐败菌均为希瓦氏菌属;日本鲭体内与TVB-N产生相关的菌共12种,其中10种与组胺产生具有显著相关性;大黄鱼体内与TVB-N产生相关的菌共7种,但未检测出与组胺产生具有相关性的细菌;冷藏过程中氨基酸代谢和碳水化合物代谢为最主要的代谢通路,日本鲭样品组氨酸、精氨酸、脯氨酸等氨基酸代谢相关基因和丁酸丁酯代谢、丙酸酯代谢及丙酮酸代谢丰度均显著高于同一时期的大黄鱼,本实验从微生物代谢水平解释了日本鲭比大黄鱼更易腐败的原因,为不同水产品腐败特性的研究提供新思路。     

大黄鱼碱性磷酸酶基因的克隆及表达特征分析

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶,是动物生物代谢过程中重要的调控酶。实验首次克隆了大黄鱼ALP基因cDNA全序列,命名为LcALP,其全长为2 345 bp,开放阅读框为1 629 bp,编码543个氨基酸。实时荧光定量PCR检测发现,LcALP在大黄鱼雌雄各组织中均有表达,其中在眼和头肾的表达量最高,雌性鳃和脑中LcALP表达量显著高于雄性,而在性腺和脾脏中的表达量则显著低于雄性;胚胎发育过程中,多细胞期、囊胚期和原肠期LcALP基因表达水平相对较低,在卵黄栓形成期明显提高,至孵出期达到峰值,而初孵仔鱼期则显著下调;大黄鱼肌肉细胞系经LPS处理后6 h LcALP表达量降低,12 h显著下调,而poly I:C处理后表达水平持续上升,24 h显著上调至峰值。研究表明,LcALP在大黄鱼胚胎发育调控以及机体免疫防御中发挥重要作用。     

大黄鱼中期染色体面积和物理长度的测定

为获知大黄鱼染色体的物理长度,实验采用流式细胞术测定了大黄鱼基因组大小,并利用显微图像分析技术测定了大黄鱼24对染色体的面积和累积光密度(IOD),据此估算了大黄鱼染色体的物理长度。结果显示,大黄鱼基因组大小约为(725.25±14.65)Mb;染色体相对面积最小为2.26%±0.08%,最大为4.83%±0.08%;染色体相对IOD最小为1.80%±0.32%,最大为5.04%±0.15%;物理长度最小的是24号染色体,为(13.1±3.37)Mb,其他染色体的物理长度为(24.4±6.21)~(36.6±1.62)Mb。染色体的物理长度与相对面积、相对长度分别成正线性相关。其中,物理长度-相对面积的相关系数大于物理长度-相对长度。显微图像还显示,同一基因组中的染色体碘化丙啶(PI)着色不完全均一,非同源染色体间、部分同源染色体间以及染色体不同位置均存在荧光强度的差异。研究结果为大黄鱼染色体识别与配对提供了新的数量标记,也为深入解析大黄鱼基因组结构提供基础数据。     

大黄鱼微卫星多重PCR体系的建立及其应用

利用本实验室开发的微卫星标记,通过优化退火温度、引物浓度、循环次数等条件,建立了3组大黄鱼微卫星多重PCR体系,每组包含3个微卫星位点,用3组微卫星多重PCR分析了一个大黄鱼选育群体JD-01的遗传多样性。结果显示,该群体的平均等位基因为12.111,平均有效等位基因为7.408,平均多态信息含量为0.846,平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.825、0.868,香农多样性指数为2.165。运用Cervus 3.0软件,对已知系谱关系的9个大黄鱼家系及对应亲本进行了亲子鉴定分析,以验证3组微卫星多重PCR在亲子鉴定中的准确性。结果显示,使用该3组微卫星多重PCR体系进行亲子鉴定准确率为100%。大黄鱼微卫星多重PCR体系的建立为分析群体的遗传多样性、亲子鉴定和辅助家系管理提供了一种高效的技术手段。     

植物精油对冷藏大黄鱼优势腐败菌的抑制作用及其机制

为探讨天然植物精油对冷藏大黄鱼贮藏过程中优势腐败菌的抑制作用及其机制,实验首先对冷藏大黄鱼的优势腐败菌进行分离纯化,并通过16S r DNA序列分析及生理生化实验进行菌株鉴定;采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测14种植物精油或其组分对腐败菌株的抑菌活性;在阐明植物精油抗菌活性的基础上,再对植物精油处理后的大黄鱼气味进行感官可接受度检验,以筛选出具有高效抗菌活性和良好感官接受性的精油保鲜剂;实验通过细菌形态扫描电镜观察、胞内乳酸脱氢酶及核酸释放研究山苍子精油对不同腐败菌株的膜损伤作用,以初步阐明其抗菌机制;最后,通过检测微生物数量、产硫菌数量、挥发性盐基氮(TVB-N)及组胺含量变化来考察山苍子精油对冷藏大黄鱼潜在的保鲜效果;从冷藏大黄鱼中分离得到6株优势腐败菌,分别为腐败希瓦氏菌4株,热杀索丝菌1株,温和气单胞菌1株;14种植物精油对腐败菌株具有不同抑制活性,其中肉桂醛抑菌活性最强,最低抑菌浓度为0.125μL/mL,其次为丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油,最低抑菌浓度均≤0.5μL/mL;丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油使用后未导致大黄鱼气味的感官劣化,且可矫正大黄鱼肉的腥味;山苍子精油可破坏腐败菌株的细胞膜,并导致胞内蛋白酶和核酸外泄。经4μL/mL山苍子精油处理后,冷藏过程中大黄鱼片的菌落总数、产硫菌数、TVB-N及组胺含量显著降低。研究表明,肉桂醛、丁香酚、百里香酚、柠檬醛、柠檬草及山苍子精油对大黄鱼特定腐败菌具有显著抑制作用,芳香酚和富含柠檬醛的精油使用后不影响大黄鱼的感官接受性,有望作为天然保鲜剂用于冷藏海产品的保鲜。     

核苷酸对大黄鱼生长性能、肠道形态和抗氧化能力的影响

为探究饲料中添加核苷酸对大黄鱼生长性能、肠道形态和抗氧化能力的影响,实验选取初始体质量为(7.71±0.02)g的大黄鱼幼鱼为研究对象,设置2个对照组,即高鱼粉对照组FM(鱼粉含量为45.0%)和低鱼粉对照组N0(鱼粉含量为31.5%),在低鱼粉对照组基础上分别添加0、75、150、300、600和1 000 mg/kg的核苷酸,共配制出7种等氮等脂饲料,在海水浮式网箱中进行为期63 d的养殖实验。结果表明:饲料中添加核苷酸对大黄鱼的存活率、饲料效率、摄食率、鱼体组成和形体指标没有显著影响(P0.05);但增重率随着核苷酸添加量的增加呈先升高后下降趋势,在添加量为300~600 mg/kg时显著高于其他处理组(P0.05)。随着核苷酸添加量的增加,血清中超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化力(T-AOC)的活力呈先升高后下降的趋势,并在300 mg/kg时显著高于低鱼粉对照组(P0.05)。核苷酸对大黄鱼肠道肌肉层厚度和微绒毛高度有显著影响(P0.05),分别在添加量为150和300mg/kg时出现最大值;而对肠道褶皱高度无显著影响(P0.05)。结果表明,饲料中添加核苷酸能促进大黄鱼生长,改善肠道形态结构和增强机体的抗氧化能力。以增重率为指标,利用折线模型计算得到大黄鱼幼鱼饲料中核苷酸的适宜添加量为194.91 mg/kg。     

运输密度和盐度对大黄鱼幼鱼皮质醇、糖元及乳酸含量的影响

为了确定大黄鱼运输的适宜条件,实验选取平均体质量为(0.12±0.03)g的大黄鱼幼鱼为实验对象,采取析因设计,设3个运输密度(2、4和8 g/L)和5个运输盐度(5、10、15、20和25),共计15个处理组研究了不同密度和盐度运输条件下,大黄鱼幼鱼皮质醇、糖元及乳酸含量的变化。经过水温16.5℃、10 h的运输,统计各组的死亡率,测定各组水中总氨氮含量。结果显示,在运输结束后,4和8 g/L密度组死亡率(1.33%、2.63%)显著高于2 g/L密度组(0.77%),盐度25组死亡率(0.44%)显著低于盐度10、15组(1.94%、1.67%),盐度10、15组死亡率显著低于盐度5组(2.72%),各组水中总氨氮含量较运输前(0.15 mg/L)均显著升高,各密度组水中总氨氮含量均有显著性差异,高密度组总氨氮含量高于低密度组,8 g/L密度条件下盐度5组水中总氨氮含量(1.63 mg/L)显著高于盐度15(1.38 mg/L)、盐度20(1.34 mg/L)和盐度25(1.31 mg/L)组,4 g/L密度条件下盐度5组水中总氨氮含量(1.31mg/L)显著高于其他各盐度组,2 g/L密度条件下盐度5组水中总氨氮含量(0.83 mg/L)显著高于盐度25组(0.49 mg/L);运输胁迫导致各组皮质醇含量均较运输前(6 476.35 ng/L)显著升高,各组间皮质醇含量无显著性差异;各组糖元含量均较运输前(4.37 mg/g prot)显著降低,运输后各组间糖元含量无显著性差异;各组乳酸含量均较运输前(0.57 mmol/g prot)显著升高,运输后各密度组间乳酸含量无显著性差异,3个密度下盐度5组乳酸含量(1.91、2.02、1.76 mmol/g prot)均显著高于盐度20(1.55、1.21、1.69 mmol/g prot)和盐度25组(1.36、1.44、1.26 mmol/g prot),盐度10组乳酸含量(1.77、1.83、1.60 mmol/g prot)显著高于盐度25组(1.36、1.44、1.26 mmol/g prot)。研究表明,较高的运输密度和较低的盐度会加重大黄鱼的应激性反应,在本实验条件下,规格为0.1 g左右的大黄鱼幼鱼,其运输密度不宜超过8g/L,盐度不宜低于5。     

饲料脂肪水平和投喂频率对大黄鱼生长、体组成及脂肪沉积的影响

本实验以我国重要的海水养殖鱼类大黄鱼[初始体质量(13.57±0.33)g]为研究对象,在浮式网箱中进行为期8周的摄食生长实验,探讨饲料脂肪水平和投喂频率对大黄鱼生长、体组成及脂肪沉积的影响。采用3×2双因子实验设计,其中饲料脂肪水平分别为9%、12%和15%,投喂频率分别为2次/天和1次/天。结果表明:投喂频率对大黄鱼特定生长率(SGR)和饲料效率(FER)均有显著影响(P<0.05),而饲料脂肪水平仅对FER有显著影响(P<0.05)。2次/天投喂组的大黄鱼末体质量和SGR均显著高于1次/天投喂组,而饲料效率显著低(P<0.05)。在2次/天投喂时,各个饲料脂肪水平对SGR和FER没有显著影响(P>0.05)。而在1次/天投喂时,随着饲料脂肪水平的提高,SGR和FER均显著提高(P<0.05)。2次/天投喂组的大黄鱼全鱼水分含量显著低于1次/天投喂组,而粗脂肪含量显著高(P<0.05)。大黄鱼全鱼粗脂肪含量随着饲料脂肪水平的增加而显著升高(P<0.05)。然而在1次/天投喂时,饲料脂肪水平未对全鱼体粗脂肪含量产生显著影响(P>0.05)。大黄鱼的肝脏和肌肉脂肪含量、肝体比(HSI)以及脏体比(VSI)受到了饲料脂肪水平的显著影响(P<0.05)。在2次/天投喂时,肝脏和肌肉脂肪含量、HSI以及VSI随饲料脂肪水平的升高而显著增加(P<0.05);而在1次/天投喂时,各个饲料脂肪组大黄鱼肝脏和肌肉脂肪含量、HSI以及VSI均无显著差异(P>0.05)。饲料脂肪水平和投喂频率仅对大黄鱼的生长、饲料效率的影响存在显著的交互作用(P<0.05),而对大黄鱼体组成、形态学指标以及肝脏和肌肉脂肪含量无显著的交互作用(P>0.05)。