华北大黑鳃金龟气味受体OrCo基因的克隆及序列分析

嗅觉受体OrCo(olfactory receptor coreceptor)在不同昆虫体内高度保守,克隆华北大黑鳃金龟[Holotrichiaoblita(Falderman)]OrCo基因可以为进一步探索受体在气味识别过程中所起的作用和功能提供基础。本研究利用RT-PCR和RACE方法,克隆获得华北大黑鳃金龟OrCo受体基因cDNA全长序列。将该基因命名为Hobl/Or-Co。序列分析结果显示,Hobl/OrCo全长共1 598bp,开放阅读框全长1 434bp,编码477个氨基酸,序列中有7个跨膜区和高度保守的C端区域。Hobl/OrCo基因的氨基酸序列与近缘种铅灰齿爪鳃金龟嗅觉受体的同源性高达95.39%,与已经报道的其他昆虫的嗅觉受体同源性在76%以上,特别是在C端几乎完全一致。     

异色瓢虫乳酸脱氢酶基因的克隆与序列分析

乳酸脱氢酶（1acticdehydrogenase,LDH）是糖酵解途径的终止酶,在整个昆虫的发育阶段长期存在。本试验采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫Harmoniaaxyridis中克隆到HaxLDH基因的cDNA全序列（GenBank登录号HM362898）,全长1336bp,包含214bp的3’非编码区域和123bp的5,非编码区域,可读框长999bp,编码332个氨基酸。通过软件分析,预测该基因编码蛋白的分子量为36．2kD,理论等电点为8．62;包含1个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。同源比对不同昆虫的LDH基因cDNA序列,发现HaxLDH拥有8个非常保守的结构域：DLQHG、TAGV／ARQK／RE／DGES／TRL、LVQRN、GSGTNLD、SCHGW／YI／VI／VGEHGD、VWSG／AVNV／IAGV、AYEV／IIK／RLKGYTS／NWAI／VGLS和LSLP。HaxLDH与赤拟谷盗Triboliumcastaneum的LDH同源性最高,达67％;系统发育分析也表明二者亲缘关系较近。本研究为探讨LDH在昆虫发育和逆境中的作用奠定了基础。     

赤拟谷盗β1-微管蛋白cDNA基因的克隆及序列分析

本研究利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术对赤拟谷盗Tribolium casta-neum体内β1-微管蛋白(β1-tubulin)基因进行了克隆,获得的基因(EU555191)全长为1573bp,包含1344bp的完整开放阅读框(ORF)。根据该基因推导出447个氨基酸序列,理论分子量约为50KD,等电点为4.68,该序列含有2个氨基酸保守区:NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE,并且在该基因的5’端启动子调控区发现TATA-box保守基因序列。系统发育关系研究表明:本研究扩增出的基因与其它昆虫β-tubulin基因序列有较高的同源性,达90%左右。     

基于28SrRNA基因的PCR-RFLP分析对赤拟谷盗与杂拟谷盗进行分子鉴定

本研究拟利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法对赤拟谷盗Tribolium castaneum(Herbst)和杂拟谷盗Tribolium confusum(Jac du Val)进行分子鉴定,以期为仓储害虫管理和口岸检疫提供技术帮助和支持。采用通用引物对赤拟谷盗和杂拟谷盗的28S rRNA基因进行了PCR扩增、序列测定和分析,结果发现:扩增片段长约1070 bp,该序列种内均无变异位点、种间有76个变异位点,即种内没有核苷酸替换发生、种间核苷酸替换发生76次,其中转换56次,颠换20次,转换/颠换的比值为2.80。用限制性内切酶PvuI对赤拟谷盗和杂拟谷盗的28S rRNA基因扩增产物进行酶切,电泳检测显示,赤拟谷盗和杂拟谷盗的28S rRNA基因扩增产物的PvuI酶切图谱(分别产生2个和3个酶切条带)明显不同,因此本研究建立的28S rRNA基因PCR-RFLP方法可用于赤拟谷盗与杂拟谷盗的分子鉴定。     

小菜蛾GluCl受体α亚基cDNA基因克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术对小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]4龄幼虫谷氨酸门控的氯离子通道(GluCl)受体cDNA全长进行了克隆和序列分析。通过设计简并性上、下游引物扩增出小菜蛾GluCl受体α亚基基因192bp的cDNA片段,根据得到的片段序列设计3′和5′特异性引物采用RACE技术进行3′和5′末端的克隆,获得了小菜蛾GluCl受体的cDNA的完整序列,GenBank登录号为GQ221939。该基因全长2144bp,其开放阅读框(ORF)1344bp,编码447个氨基酸。相似性分析表明:它与果蝇和赤拟谷盗的相似性均为73%,与埃及伊蚊的相似性为75%,与东亚飞蝗的相似性为79%;氨基酸分析后显示它具有GluClα亚基的典型特征,表明克隆的cDNA序列是小菜蛾GluClα亚基基因的序列。     

淡紫拟青霉γ-actin基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用同源克隆的策略对淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)γ-actin基因进行克隆,获得了淡紫拟青霉γ-ac-tin基因cDNA全长。该基因cDNA的ORF长1128bp,编码375个氨基酸,具有actin基因的保守特征序列。由该基因推导的氨基酸序列与多个子囊菌的γ-actin蛋白序列相似性达98%以上。系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致。     

桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA克隆及其生物信息学分析

克隆获得桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确钠离子通道的典型特征，为研究桃蚜抗性分子机理奠定基础。采用实验技术主要有RT-PCR和PCR，克隆桃蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用相关软件对其序列进行生物信息学分析。克隆得到两段cDNA序列MpNa_v-1（NCBI登录号：MN124170）和MpNa_v-2（NCBI登录号：MN176136）。MpNa_v-1长度为2945 bp，包括2877 bp的完整开放阅读框，共编码958个氨基酸；MpNa_v-2长度为3546 bp，包括3486 bp的完整开放阅读框，共编码1161个氨基酸。MpNa_v-1和MpNa_v-2共同组成桃蚜的钠离子通道α亚基，MpNa_v-1包含同源结构域Ⅰ和同源结构域Ⅱ，MpNa_v-2包含同源结构域Ⅲ和同源结构域Ⅳ。同源比对发现，桃蚜与豌豆蚜和高粱蚜钠离子通道基因相似度分别高达97.67%和97.65%，所克隆序列包含昆虫钠离子通道α亚基典型特征，具有MFM模块，并含有蚜虫类钠通道特有模块DENS。成功地克隆桃蚜钠离子通道基因，为阐明其对拟除虫菊酯类药剂产生靶标抗性的分子机制奠定基础。     

西花蓟马FoccOBP3的分子克隆、序列分析及表达特征

鉴定昆虫嗅觉相关蛋白基因并对其序列和时空表达进行研究,可为阐明昆虫与寄主间的化学通讯机制提供依据.本文新克隆并鉴定获得一个西花蓟马OBP基因FoccOBP3(GenBank登录号:MT682352),cDNA序列全长1226bp,读码框全长432bp,编码143个氨基酸残基.氨基酸序列中六个保守的半胱氨酸位点排列方式为...     

暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因的细胞表达及活性分析

cDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因,序列分析表明HpCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于Group V类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-HpCDA5,转染昆虫细胞sf9,Western blot分析表明HpCDA5在昆虫细胞sf9中成功表达42 kDa的蛋白。利用qRT-PCR方法分析HpCDA5基因组织表达,结果显示HpCDA5基因在中肠中表达最高,为中肠特异表达蛋白。几丁质结合活性表明HpCDA5蛋白只能被强洗脱剂洗脱,具有很强的几丁质结合活性。本研究通过对暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5的生化特性研究,为进一步明确HpCDA5的生理功能提供理论依据,并为以HpCDA5蛋白为靶标的暗黑鳃金龟生物防治提供支撑。     

云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因的克隆与序列分析

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一种广泛存在于生物体各组织,在机体抗氧化过程中起着重要作用的抗氧化酶。采用RACE技术,克隆获得了云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因。该基因cDNA序列全长768bp,开放阅读框为462bp,编码153个氨基酸。预测蛋白质分子量为15.8ku,等电点为5.68。同源性比对分析发现,云南切梢小蠹SOD与中欧山松大小蠹SOD在氨基酸水平上相似性高达93%,与赤拟谷盗、点蜂缘蝽、侵扰锥猎蝽、丽蝇蛹集金小蜂、佛罗里达弓背蚁、柑橘凤蝶、棉铃虫、黑果蝇、家蝇的相似性也都在67%~71%之间。其推导的氨基酸序列中含有2个Cu/Zn-SOD的特异序列(GFHIHEFGDNT42-52和GNAGGRLACAVI136-147),Cu原子分别与His44、His46、His61和His118配位,Zn原子分别与His61、His69、His78和Asp81配位,半胱氨酸Cys55和Cys144基之间形成Cu/Zn-SOD链内二硫键。系统进化树分析表明,克隆获得的云南切梢小蠹SOD隶属于铜锌SOD家族(icCu/Zn-SOD)。实时荧光定量PCR表明,icCu/Zn-SOD基因在云南切梢小蠹各发育阶段和不同部位均有表达,但表达量各不相同。     

甜菜夜蛾中肠碱性磷酸酶alp2基因的克隆、表达及功能分析

为探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua中肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase protein 2,ALP2)是否为Cry1Ac杀虫蛋白的受体,采用同源克隆和RACE技术克隆了编码alp2基因的完整c DNA序列,利用荧光定量PCR比较了甜菜夜蛾幼虫中肠不同龄期ALP2表达量的差异,利用Ligand blot方法检测了中肠ALP2与Cry1Ac杀虫蛋白的结合。结果表明,alp2基因序列全长1 629 bp(Gen Bank序列号为KP420013),编码542个氨基酸,预测在氨基酸序列N端包含1个由21个氨基酸组成的信号肽,在C端存在1个GPI修饰的锚定位点,且在整个氨基酸序列中存在多个糖基化修饰位点。在整个甜菜夜蛾幼虫期均有ALP2表达,但不同龄期的表达量差异显著,1龄幼虫期表达量最低,4龄幼虫期最高。Ligand blot方法检测结果表明原核表达的ALP2片段与活化的Cry1Ac杀虫蛋白可以结合。研究表明,甜菜夜蛾中肠的ALP2可能是Cry1Ac的受体之一。     

莲草直胸跳甲羧酸酯酶基因AhCesB1的克隆、序列分析及表达特征

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是入侵杂草喜旱莲子草的专食性天敌。为进一步明确莲草直胸跳甲寄主专一性的分子机制,通过分析其转录组数据克隆羧酸酯酶(carboxylesterases,Car Es)基因,采用RT-PCR技术从其体内获得1个羧酸酯酶B簇基因并进行生物信息学分析,同时利用实时定量PCR方法检测其在不同身体部位及不同发育阶段的表达特性,并对饥饿处理、取食靶标植物喜旱莲子草和非靶标植物莙荙后该基因的表达水平进行比较。结果显示,克隆得到1条莲草直胸跳甲羧酸酯酶基因的cDNA全长序列,长度为1 851 bp,开放阅读框长度为1 647 bp,编码548个氨基酸,以该基因推导的氨基酸序列与其它物种的CarEs进行聚类分析,发现此基因为羧酸酯酶B簇家族成员,命名为AhCesB1(GenBank登录号KT032151)。实时定量PCR检测结果显示,AhCesB1基因在莲草直胸跳甲3龄期表达量最高,成虫期和蛹期表达量次之,卵、1龄和2龄期表达量相对较低。AhCesB1基因在头和中肠的表达量较低,在其余身体部分表达量较高。取食莙荙后AhCesB1表达量显著增高,为饥饿处理的13.7倍,而取食喜旱莲子草与饥饿处理并无显著差异。表明莲草直胸跳甲AhCesB1在不同发育阶段和成虫不同身体部位具有不同的表达水平,而非寄主植物莙荙可以诱导该基因的表达,推测羧酸酯酶在莲草直胸跳甲代谢次生物质中发挥着重要作用。     

棉铃虫V-ATP酶亚基A基因克隆及表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase,V-ATP酶)亚基A对棉铃虫生长发育的影响及其在Bt杀虫机制中的作用,采用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫V-ATP酶亚基A基因序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在棉铃虫不同发育历期和幼虫肠道不同组织中的表达量;并比较了4龄幼虫取食含Cry1Ac蛋白饲料后中肠中该基因表达量的变化。结果显示,棉铃虫V-ATP酶亚基A基因全长2 578 bp(Gen Bank登录号KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。V-ATP酶亚基A高度保守,不同物种间氨基酸序列同源性大于90%。V-ATP酶亚基A在棉铃虫整个生育期都有表达,在4龄幼虫体内表达量最高,是卵期的3.00倍;在幼虫肠道不同组织中,中肠中表达量最高,是后肠中的2.65倍。4龄棉铃虫幼虫取食含Cry1Ac蛋白的人工饲料后,中肠V-ATP酶亚基A的表达受到抑制,表达量为对照的0.39~0.81倍。表明V-ATP酶亚基A基因可能参与棉铃虫的生长发育和代谢过程,并可能与抵御Cry1Ac的毒杀作用有一定关系。     

黄翅绢丝野螟气味受体基因GcaeOR10的鉴定及组织表达分析

为明确黄翅绢丝野螟Glyphodes caesalis气味受体基因GcaeOR10(GenBank登录号MW701397)的生物信息学特征及组织表达谱,使用生物信息学软件对其进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)技术检测其在黄翅绢丝野螟成虫不同组织中的表达量。结果显示,黄翅绢丝野螟GcaeOR10基因开放阅读框（open reading frame,ORF）全长为1 200 bp,编码399个氨基酸残基,预测其编码的蛋白质分子量为45.67 kD,等电点为8.65,无信号肽,具有昆虫气味受体家族7个跨膜蛋白（7 transmembrane proteins,7tm-6）超家族的保守结构域,存在26个潜在的磷酸化位点,含有7个跨膜结构域,且N端位于细胞膜内,C端位于细胞膜外。黄翅绢丝野螟GcaeOR10与桑螟Glyphodes pyloalis的GpylOR17亲缘关系最近,其次与松蛀螟Conogethes pinicolalis的CpinOR39、CpinOR36和桃蛀螟Conogethes p...     

黏虫体内两种微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

以黏虫4龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到该虫的α和β微管蛋白基因的cDNA序列各1条。其中α微管蛋白基因的cDNA序列1 443个碱基,包括一个1 353个碱基的开放阅读框,编码一个含450个氨基酸的蛋白,分子量约为50.0ku。氨基酸的142~148位存在一个微管蛋白标志信号片段GGGTGSG,在氨基酸序列的C-端有一个酪氨酸残基,N-端存在一个对转录后调控非常重要的保守区MRECI序列,以上特点与其他昆虫α微管蛋白氨基酸序列相同。黏虫β微管蛋白基因cDNA序列含1 906个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2ku,等电点4.75。1~4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140~146GGGTGSG位同样存在一个微管蛋白标志信号片段。序列比对表明,克隆的α和β微管蛋白基因与其他昆虫的α和β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,黏虫与家蚕(Bombyx mori)α微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.3%,与其他3种夜蛾科昆虫α微管蛋白的氨基酸序列同源性更是达到100%。黏虫与家蚕β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与烟草天蛾β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.6%。两个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号分别为EU100016和EU234504。     

A spruce defensin showing strong antifungal activity and increased transcript accumulation after wounding and jasmonate treatments

In this work, a cDNA encoding a defensin from Picea glauca, named PgD1, was isolated. The corresponding PgD1 cDNA encodes a putative protein of 83 amino acids with a calculated molecular mass of 8.9 kDa. The mature protein of 50 amino acids is characterized by the presence of specific highly conserved residues common to all plant defensins. PgD1 is developmentally expressed during seed germination and is also up-regulated by wounding and by jasmonic acid treatment, suggesting a role in both the constitutive and induced defense mechanisms. The recombinant protein was found to cause extensive growth inhibition of three fungal pathogens (Cylindrocladium floridanum, Fusarium oxysporum and Nectria galligena) at 2.5 μM.     

粘虫脂动激素基因MsepAKH1的克隆与成虫期表达模式分析

为明确脂动激素基因AKH在粘虫Mythimna separata(Walker)能源代谢过程中的作用,采用RT-PCR和RACE技术克隆得到粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA全长,并通过实时荧光定量PCR技术测定该基因在成虫期的组织与发育阶段表达模式。结果表明,粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA序列全长为449 bp,GenBank登录号为KP979739.1,开放阅读框为207 bp,编码68个氨基酸,具有昆虫脂动激素基因家族典型的结构特征;预测该基因编码的MsepAKH1蛋白分子量为7.61 kD,等电点为8.46,MsepAKH1的氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta、二化螟Chilo suppressalis、小菜蛾Plutella xylostella、棉铃虫Helicoverpa armigera、家蚕Bombyx mori的AKH氨基酸序列同源性较高。MsepAKH1基因在粘虫初羽化雌蛾不同组织间的表达量差异显著,主要在头部和飞行肌内表达,分别约为同日龄雌蛾脂肪体内表达量的15.4倍与8.1倍,在脂肪体、卵巢与中肠内的表达量显著降低。对不同日龄雌蛾头部和飞行肌内的表达量检测发现,在7日龄雌蛾头部和3日龄雌蛾飞行肌内的表达量分别显著高于其它日龄雌蛾相同组织中的表达量,分别约为初羽化雌蛾相同组织表达量的2.4倍与1.6倍。表明MsepAKH1基因的表达因粘虫雌蛾组织与日龄间的不同而呈现动态变化。     

Biochemical Characterization of Carboxylesterase in the Small Brown Planthopper Laodelphax striatellus (Fallén)

Several forms of carboxylesterase were observed in a malathion-resistant small brown planthopper, Laodelphax striatellus Fallén, by isoelectrofocusing. To study the mechanisms of increased esterase activity, esterases were purified and their biochemical characteristics were investigated in five active esterase isozymes of two resistant strains. These esterases have polymorphic characteristics and their molecular weights ranged from 66 to 70 kDa, due to variations in glycosylation. The pI values of these esterases ranged from 5.3 to 4.7. These esterases were immunologically related and NH₂-terminal amino acids were identical in all isozymes regardless of pI or molecular weight. No differences have been found in kinetic parameters (K_m and V_max) to α-naphthylacetate and specific activity toward α-naphthylacetate and malathion as a substrate in all isozymes. Resistant individuals showed high ali- and malathion carboxylesterase activities and these enhancements were caused by quantitative differences of carboxylesterases with several different pI.     

禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的克隆、分子特性和表达分析

为探究禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi (Linnaeus)水通道蛋白基因RpAQP1的序列特征及其在不同龄期的表达,利用RT-PCR和RACE技术克隆了RpAQP1基因的cDNA全序列,采用生物信息学软件分析了RpAQP1编码蛋白的特性,利用qRT-PCR分析了RpAQP1在不同龄期的表达量。结果显示:禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的cDNA全长为1 216 bp,其750 bp的开放阅读框编码250个氨基酸,蛋白分子量为27.36 kD。RpAQP1属于水通道蛋白亚家族DRIP(果蝇内嵌蛋白Drosophila integral protein)的一员,具有6个跨膜区,2个保守的NPA结构单元和1个压缩区域Ar/R;qRT-PCR结果显示,RpAQP1在整个发育历期均有表达,其在2龄若蚜中表达水平最高,是成蚜表达量的1.432倍;在4龄若蚜中表达量最低,为成蚜表达量的0.444倍,显著低于其它龄期,而其余各龄期RpAQP1表达量无显著差异。     

基于稻纵卷叶螟触角转录组的羧酸酯酶类气味降解基因CXE66鉴定及其表达谱

为了解稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis气味降解机制,利用稻纵卷叶螟基因组和触角转录组鉴定羧酸酯酶（carboxylesterase,CXE）基因,同时采用同源比对和系统发育进化树对其进行分类,进一步克隆获得稻纵卷叶螟CXE66的全长序列,并采用实时荧光定量PCR分析该基因在各组织中的表达情况。结果显示,共鉴定出触角特异性表达的45个CXE基因,其中新发现29个CXE,分属于CXE八个亚族。触角组织中高表达的CXE66基因开放阅读框长1 605 bp,编码534个氨基酸,且具有典型CXE结构特征,其在稻纵卷叶螟触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,且在触角中表达量最高。表明45个CXE基因可能参与稻纵卷叶螟的气味降解和性信息素降解、有毒物质代谢、蜕皮发育和神经发育等生理生化过程,其中CXE66可能参与酯类植物挥发物的降解。