进境犬中检出犬细小病毒和梨形虫初报

犬细小病毒(CPV)和梨形虫分别是危害犬的重要的病毒和寄生虫,两者都是我国对外检疫名录中规定的检疫对象。1994年5月间,南京动植物检疫局在从香港引进犬中同时检出犬细小病毒和梨形虫,这些犬混合感染了犬细小病毒和吉氐巴贝氐焦虫,这在国内尚未见报道。 发病情况和临床症状 1994年4月21日和4月31日,江苏某公司从香港引进2月龄挪威那犬19头,入境时有咳嗽、流泪症状,体质虚弱,食欲差,隔离检疫期间相继出现上吐下泻、发烧、结膜炎。腹泻随时间延长而加重,粪便成结或流体状,灰色或黄色,体重迅速减轻,脱     

鸢尾黄斑病毒几种PCR检测方法的建立和比较研究

 以带有鸢尾黄斑病毒的烟草叶片为材料,研究建立了IYSV的普通RT PCR、免疫捕获RT PCR和SYBR Green Ⅰ实时荧光RT PCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。结果表明,DAS ELISA检测灵敏度较低,为1 mg带毒叶片。而各种PCR方法的灵敏度均高于DAS ELISA 100倍以上,其中SYBR Green Ⅰ实时荧光RT PCR检测灵敏度最高,可从0.4 μg的带毒叶片中检出IYSV,而RT PCR的灵敏度为40 μg带毒叶片,IC RT PCR的检测灵敏度是RT PCR的4倍。鉴于DAS ELISA灵敏度较低,建议在用ELISA初筛时,如样品OD405值与阴性对照OD405值之比在2.0左右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。     

美人蕉黄斑驳病毒巢式PCR检测方法的建立

本文以我国台湾进境美人蕉病株为材料,根据已报道的美人蕉黄斑驳病毒Canna yellow mottle virus(CaYMV)基因序列设计2对特异性引物(外侧引物1对、内侧引物1对),建立了巢式PCR快速检测CaYMV的方法,并对进境的50份美人蕉样品进行了检测。结果显示,该方法特异性强,且灵敏度高于常规PCR,是常规PCR的1 000倍,表明该方法能够实现对CaYMV的快速、准确、灵敏检测,适用于口岸快速检测CaYMV。     

洋葱腐烂病菌PCR检测方法的建立

为了快速准确检测洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv. alliicola,简称Bga）,根据GenBank中Bga与相关种的序列差异设计特异引物BG5/BG7和探针Bga-P,建立了Bga常规PCR和荧光PCR检测方法。测试结果表明,引物和探针对供试的11株Bga菌株表现为阳性反应,其他64株供试菌株和空白对照均为阴性。常规PCR和荧光PCR方法的检测灵敏度分别为24 pg和240 fg菌体DNA。美国、法国、意大利等国进境的80批次洋葱种子样品的检测结果显示,这两种方法的阳性检出率分别为7.5%和12.5%。选取阳性样品进行病菌分离,成功从2批次法国进境洋葱种子中分离到目的菌。本文建立的洋葱腐烂病菌PCR检测方法可为口岸检测部门提供更高效、灵敏和特异的检测手段。     

南芥菜花叶病毒的几种PCR检测方法的建立和比较研究

 以进境种球中截获的带毒洋水仙和郁金香为试验材料,建立了ArMV的免疫捕获RT-PCR、巢式PCR和Real-time PCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。DAS-ELISA的检测灵敏度较低,为1mg洋水仙或10mg郁金香带毒种球,而各种PCR方法的灵敏度可高于DAS-ELISA 100倍以上,其中Real-time PCR检测的灵敏度最高,可从20ng洋水仙或2μg郁金香的带毒种球中检出ArMV。鉴于DAS-ELISA灵敏度较低,建议在用ELISA初筛时,如样品OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比在2.0左右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。     

应用PCR方法检测烟粉虱传双生病毒

番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒,根据其外壳蛋白基因保守序列设计简并引物,对杭州和海宁地区番茄上疑似番茄黄化曲叶病毒进行PCR检测,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序和序列分析,表明杭州和海宁地区发生的病毒是番茄黄化曲叶病毒,并且两地区病毒核苷酸序列同源性达97.5%。     

双重PCR检测马铃薯晚疫病菌和青枯病菌方法的建立及应用

 利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增马铃薯晚疫病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列比较,设计了1对马铃薯晚疫病菌的特异引物INF1/INF2,并对15种不同真菌、细菌和7种疫霉属和腐霉属卵菌基因组DNA进行PCR扩增,结果只有不同来源的马铃薯晚疫病菌株可获得324 bp的特异带。将引物INF1/INF2与卵菌通用引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达30 fg。运用设计的引物与马铃薯青枯病菌特异引物结合建立了双重PCR体系,能从马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌总基因组DNA以及人工接种和自然发病的马铃薯植株中分别或同时扩增到324 bp和281 bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌的快速可靠检测。     

马铃薯X病毒荧光定量PCR检测体系的建立及应用

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是危害茄科作物的一种重要病毒,为了建立特异性检测PVX的实时荧光定量PCR体系,本研究以PVX-1985分离物中外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列为模板,设计引物构建重组质粒并选择扩增效率高、特异性强的引物成功构建出标准曲线。利用建立的体系,成功检测到以含pCaPVX440侵染性克隆载体的农杆菌C58C1接种后的本氏烟(Nicotiana benthamiana)中PVX病毒RNA的拷贝数。     

数字PCR在转基因植物检测中的应用

随着转基因植物种植规模不断扩大,对其中转基因成分检测也提出了新的要求。近年来,数字PCR作为一种新兴的分子生物学技术在其检测方面得到了广泛应用。本文主要介绍了数字PCR的原理及数字PCR在转基因检测中的应用优势,并对转基因植物检测中的转基因成分定量检测、标准物质制备与定值及外源基因拷贝数鉴定等应用进行了总结。     

烟粉虱中甘薯双生病毒(sweepoviruses)半巢式PCR快速检测技术的建立与应用

甘薯双生病毒(sweepoviruses)是侵染甘薯的一类重要病毒,通过烟粉虱以持久方式传播,我国甘薯上至少存在8种甘薯双生病毒.本研究根据我国已报道的8种甘薯双生病毒基因组保守区设计了一组引物,建立了单头烟粉虱中甘薯双生病毒的半巢式PCR快速检测方法.特异性和灵敏性分析结果表明,半巢式PCR具有较高的特异性和灵敏性,...     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

葡萄霜霉病菌PCR检测方法的建立与应用

通过对已测序和已报道的葡萄霜霉病菌［Plasmopara viticola (Berk et Curtis) Ber.et de Toni］细胞色素c氧化酶亚型2（cytochrome c oxidase Ⅱ,cox2）的基因序列进行同源性比对分析,设计合成了一对用于P.viticola的检测引物F Pv/R Pv。利用该引物对包括P.viticola在内的30种常见植物病原真菌（包括15种Plasmopara属真菌、8种葡萄常见致病菌）的基因组DNA进行了PCR扩增,验证引物F Pv/R Pv的特异性,结果表明：该引物特异性强,仅P.viticola基因组DNA作为模板的PCR扩增产物呈现一条600 bp左右的特异性条带,其他参照菌株及阴性对照均无任何条带;灵敏度验证结果表明,该检测法可以检测出3.3 pg/μL 水平的P.viticola基因组DNA;应用该方法对来自全国不同葡萄产区的不同品种的78份葡萄霜霉病菌进行了检测,结果表明,该检测法适用范围广,且检测准确率达100%。     

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

采用实时荧光PCR技术建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的检测方法。根据瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,设计了该病菌特异性引物和TaqMan探针,并对所设计的引物和探针的反应条件进行了优化。采用本试验建立的实时荧光PCR方法对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,可将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开。灵敏度试验表明,25μL体系中只要有39.6pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到1.584pg/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。同时对田间采集的病株和未知样品进行的检测证明了引物和TaqMan探针的特异性。     

禾谷镰孢菌产玉米赤霉烯酮毒素zearalenone的PCR检测

玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）是由镰孢菌产生的真菌毒素,该毒素具有雌性激素生物活性。PKS4基因是禾谷镰孢菌中玉米赤霉烯酮生物合成途径中的必需基因。根据PKS4基因序列,设计一对PKS4基因特异性引物,通过检测PKS4基因的存在间接检测ZEN毒素的产生。特异引物在禾谷镰孢菌菌株以及被禾谷镰孢菌侵染的小麦籽粒中都能稳定地扩增出大小为1 076 bp的特异片段,扩增片段与PKS4基因（DQ019316）相同区段序列相似性达99.63%。同时,酶联免疫吸附法（ELISA）验证了PCR的检测结果,证明了该技术的可靠性。     

应用实时荧光PCR检测苹果果实球壳孢腐烂病菌

根据苹果果实球壳孢腐烂病菌(Sphaeropsis pyriputrescens Xiao&J.D.Rogers)ITS区序列设计特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了苹果果实球壳孢腐烂病菌的实时荧光PCR检测方法。该方法能够特异性检测苹果果实球壳孢腐烂病菌,供试的目标菌株检测结果为阳性,而苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、苹果干腐病菌和苹果褐腐病菌、苹果腐烂病菌等5种对照菌株检测结果为阴性。该方法具有快速、简便、准确的优点,适合于该病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌

 根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。      

江西省大余县柑橘黄龙病菌PCR检测

采用PCR扩增和核苷酸序列测定技术,对分别采自江西省大余县青龙镇郭屋坝果园和丰顺果园的各5份疑似柑橘黄龙病样品进行病原检测。结果表明:2个青龙郭屋坝果园样品中检测到柑橘黄龙病菌,分别命名为DY-LAS01和DY-LAS02,其他8份样品中则未检测到该病菌。此结果表明大余县已有柑橘黄龙病发生,希望引起当地有关部门的高度重视。     

进境苹果果实中梨火疫病菌的套式PCR检测

 针对进境商用苹果果实携带梨火疫病菌Erwinia amylovora数量有限的特点,选取源于病菌pEA29质粒的2对引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2配对组合成套式PCR,其检测灵敏度可达0.15 pg菌体DNA,检测灵敏度高于EPPO推荐的单管套式PCR方法和常规PCR方法。分别利用这3种PCR检测方法对美国、新西兰、日本和智利等国进境的166批苹果样品进行检测,3种检测方法的样品阳性率分别为53.6%、38.0%和8.4%,试验结果表明此套式PCR检测方法可用于进境商用苹果的梨火疫病菌快速检测。进境样品的检测结果证实了进境商用苹果果实中存在梨火疫病菌的可能性。