康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidoxidase,ACO)基因的序列设计并合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接到PGEM-Teasyvector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp,共编码304个氨基酸残基。序列分析结果表明该序列与国外SavinKw报道的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符。推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。      

茶树多酚氧化酶基因的克隆及其序列比较

根据已经发表的多酚氧化酶基因中的保守序列 ,设计兼并引物 ,利用nest-PCR技术 ,首次克隆了茶树多酚氧化酶基因。该基因已经在GenBank上登录 ,登录号为AF2 69192。序列分析表明 ,茶树多酚氧化酶基因与其它植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性 ,尤其在铜离子结合部位 ,所有的植物基本上一致。进化树分析表明 ,茶树的多酚氧化酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组     

草菇gpd启动子的克隆及序列分析

根据已报道的gpd启动子的序列设计合成了一对引物,以草菇菌丝的基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法克隆出一条长1367bp的DNA特异片段gpd-vv。gpd-vv序列用Promoter Scan Ⅱ和Promoter Predictions软件进行分析,结果表明,其序列上有6个核心启动子区,而且除了具有一般启动子的CAAT-box、TATA-box等基本顺式作用元件外,还含有几个重要的元件如G-box,GC-motif,CTrich-motif等。经Tfsitescan Service分析,gpd-vv序列还包含多个转录因子的结合位点,包括GCR1,GCN4,AFT1,Repressor of CAR1等。      

茶叶多酚氧化酶的序列分析与结构预测

调用生物信息学方法对已在国际互联网上的生物数据库(DDBJ、Uni-Prot)注册的茶树多酚氧化酶基因的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓扑结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构进行预测与推断。结果表明:茶多酚氧化酶不具有信号肽,存在卷曲螺旋,为位于细胞质中的无跨膜的亲水性不稳定蛋白,无规则卷曲是其蛋白质结构的主要结构元件,α-螺旋与β-折叠分散于整个多肽链中,并存在2个结构功能域。     

甜瓜ACC氧化酶前导激应元件的克隆与序列分析

以甜瓜基因组ＤＮＡ为模板,利用ＰＣＲ技术扩增获得甜瓜ＡＣＣ氧化酶基因家族成员ＣＭ－ＡＣＯ１的前导顺式元件,长度为 ８８６ｂｐ。将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体上。序列分析结果表明：克隆的 ＣＭ－ＡＣＯ１基因顺式元件的核苷酸序列与已报道的相比有９９．６％同源,元件中含ＢＲＥ,ＥＲＥ,ＷＵＮ等,能接受多种外界信号刺激。      

植物多酚氧化酶分子生物学研究进展

本综述了近年来植物多酚氧化酶在分子生物学如分子结构，分子量，基因克隆、结构、特征与表达调控等方面的研究进展以及植物多酚氧化酶的应用前景。     

异戊烯基转移酶基因(ipt基因)的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

从Agrobacteriumtumefaciens(strainAKE10)中分离其质粒并以质粒DNA为模板进行多聚酶链式反应,特异扩增出一条长约720bp的DNA片段,经克隆及序列测定表明,为根癌农杆菌AKE10质粒异戊烯基转移酶基因的完整编码序列,与Genebank中公布的核苷酸序列具有100%的同源性。与A.tumefaciensPO22、Tm-4、BO542菌株和A.vitisCG474、Tm4菌株质粒中异戊烯基转移酶基因进行序列比较,同源性分别为90%、89%、86%、89%和89%;推导氨基酸序列的同源性分别为90.42%、88.23%、90.10%、89.58%和89.12%。成功构建了异戊烯基转移酶基因植物表达载体pBT,为探索植物细胞分裂素生物合成的分子机制、作用机理及激素互作等研究打下了基础。      

海南番木瓜花叶病毒全长cDNA克隆及序列分析

提取海南果园番木瓜病叶样品总RNA,反转录得到cDNA第一链,基于已报道的番木瓜花叶病毒(Papaya mosaic virus,PaMV)全长基因组序列,设计引物,PCR扩增PaMV-CP基因序列,通过测序和序列比对分析确定发病植物感染了PaMV.再通过RT-PCR扩增PaMV全长cDNA序列,克隆及测序结果表明,所获得的cDNA全长为6656 bp,与国外报道的PaMV分离物全长核苷酸序列的相似性达99.6％.     

甘蔗GA20氧化酶基因片段克隆及序列分析

以甘蔗茎尖为材料,根据其它植物的GA20氧化酶基因(GA20-oxidase)氨基酸保守区,设计一对简并引物.通过RT-PCR扩增得出1条约740 bp大小的DNA片段.将其克隆至pMD18-T载体上,而后对重组克隆进行测序,结果表明所获得的甘蔗GA20氧化酶基因片段由740碱基组成,编码246个氨基酸.该基因片段具有其它植物GA20氧化酶基因中存在的保守区:同时,与多种单子叶植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性在80%和75%以上.聚类分析显示,甘蔗和玉米最先聚类,推测在进化上具有较近的亲缘关系,其次与高梁、结缕草聚类,然后再与水稻聚类,其中进化关系最远的是簇毛麦和小麦.     

侵染湖南甘薯种质资源的曲叶病毒和杆状病毒的检测及其亲缘关系分析

采用PCR技术对2015—2016年从湖南省多个市县采集的180份甘薯种质资源进行两种DNA病毒（sweet potato leaf curl virus,SPLCV和sweet potato badnavirus,SPBV）检测,并以PCR扩增产物序列为基础,对这两种病毒的亲缘关系进行分析。结果表明：（1）180份甘薯种质资源中,22份检测出SPLCV,占总数的12.2%;32份检测出SPBV,占总数的17.8%;8份同时检出SPLCV和SPBV这两种病毒,占总数的3.9%。（2）检出SPLCV的市县有长沙、永州、怀化、邵阳、郴州、常德、娄底、益阳、岳阳和株洲;检出SPBV的市县有长沙、永州、怀化、衡阳和邵阳;检出两病毒复合侵染的市县有怀化、长沙、永州和邵阳。（3）基于病毒全基因组序列分析显示,全球已报道的36个SPLCV分离物可分为3组,本研究获得的12个湖南分离物可分别归于3个组中,其中6个归于组Ⅰ,1个归于组Ⅱ,5个归于组Ⅲ,表明湖南SPLCV具有高度多样性。（4）基于病毒运动蛋白和外壳蛋白编码基因部分序列分析显示,全球已报道的36个SPBV分离物可分为4组,绝大部分分离物属于组Ⅰ,我国1个安徽分离物单独成组（组Ⅱ）,我国2个山东分离物和1个海南分离物构成1个组（组Ⅲ）,本研究获得的2个湖南分离物其中1个归于组Ⅰ,而另1个与已报道各分离物的核苷酸序列均存在显著差异,相似性仅为74.92%,单独成组（组Ⅳ）,表明我国SPBV具有高度的变异性,存在多个变异类型。本研究结果可为湖南地区这两种病毒病防控提供依据。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

茶树多酚氧化酶基因的生物信息学分析及原核表达

通过PCR方法扩增出迎霜品种茶多酚氧化酶（PPO）的编码区序列,并将其登录于GenBank,注册号为GQ214317。生物信息学分析表明,该基因编码区全长1800bp,编码599个氨基酸,分子式为C₃₀₀₈H₄₆₇₇N₈₁₃O₉₀₀S₁₈,存在两个铜离子结合域,没有跨膜区;进化树分析表明,茶与毛叶茶亲缘关系最近。成功构建了原核表达载体pET-ppo,并转化E. coli BL21（DE3）,实现了PPO的原核表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,在71KD处有一条特异蛋白条带,与预测大小相符。     

茶树ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶是植物乙烯合成过程中的关键酶之一,对乙烯的合成具有重要的调控作用。在茶树新梢cDNA文库测序所获得ESTs基础上,利用RT-PCR技术,克隆得到编码ACC氧化酶基因的全长序列,GenBank登录号为DQ904328。该基因长1232bp,编码320个氨基酸残基,预测分子量为36.2kD,等电点5.41。多序列联配表明茶树ACC氧化酶具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树ACC氧化酶的亲缘关系最近。对经高、低温后的不同品种进行RT-PCR分析,结果发现ACC氧化酶基因的表达量与品种的抗逆性有一定的相关性。     

多酚氧化酶固定化载体研究进展

固定化酶技术是当今酶工程的研究核心,它很好的实现了酶半衰期的延长、稳定性的提高、重复利用及产物与酶的分离。茶叶多酚氧化酶是茶树中含有的一类重要的氧化酶类,在茶叶加工、深加工以及茶饮料领域有着非常重要的作用。目前酶固定化的载体有无机载体、有机载体、复合型载体以及纳米载体。本文总结了酶固定化载体的性能要求,并概述了目前多酚氧化酶固定化酶的各种载体材料。具有功能基团的纳米载体材料将是多酚氧化酶固定化载体未来发展的主要方向。     

枇杷胚性培养物ACC氧化酶基因的克隆及序列分析

以枇杷胚性培养物（Eriobotrya japonica embryonic cultures）为材料,采用同源克隆方法,从其mRNA中分离得到ACC氧化酶（ACO）基因EjACO-1,在GenBank中登录号为GQ377219。结果表明：EjACO-1大小为 1 160 bp,编码322个氨基酸。枇杷EjACO-1与苹果、桃和梨等蔷薇科植物同源性较高,而与水稻、石斛兰等单子叶植物距离较远。此外,从枇杷基因组DNA中分离了转录为EjACO-1 mRNA的基因gACO,大小为1 517 bp,在GenBank中的登录号为GU233743。生物信息学分析显示,gACO基因中含有3个内含子,大小分别为114、240、194 bp,均符合真核生物内含子通用的GT-AG法则。EjACO基因的克隆为以后研究乙烯在枇杷中的功能奠定基础。